蝙蝠蛾被毛孢虫草菌丝体粉急性毒性和致突变作用
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作者单位: 杭州 市 疾病 预 防 控制 中 心, 浙 江 杭 州 310 006
40、8Lg/ 皿。在加和不加 S9 混合 液的条 件下 采用平 板掺 入 法进行试验[3] , 每剂量做 3 皿, 重复 2 次。 413 小 鼠骨 髓细 胞 微核 试 验 选 用体 重 25~ 30g 清 洁 级 ICR 小鼠 50 只, 随机分为 5 组, 每组 10 只, 雌雄各半 。设 101 0、510、215g/ kg# bw 3 个 剂量 组, 并 设阴 性 对照 组 ( 蒸 馏水) 、阳性对照组 ( 环磷酰胺 40mg/ kg#bw) 。各组均按 30h 给受 试物法给药, 2 次给受 试物间 隔 24h。第 2 次 给受试 物 后 6h 处死动物, 取股骨骨 髓常规制片。每鼠镜检 1000 个 骨 髓嗜 多染红细胞 ( PCE) , 并计 算微 核发生 率, 以千 分率 表 示。每鼠计数 200 个 嗜多 染红 细胞, 并计 算嗜 多染 红细 胞 与成熟红细胞比值 ( PCE/ RBC) 。 414 小鼠精子 畸形试验 选用体重 25~ 30g 雄 性 ICR 小 鼠 25 只, 随即分为 5 组, 每 组 5 只。设 1010、510、215 g/ kg# bw 3 个剂量组, 并 设阴性 对照 组 ( 蒸 馏水) 和阳性 对照 组 ( 环磷酰胺 40mg/ kg# bw) 。各组 动物均采 用经口 灌胃连 续 5d 定时给药, 各组均 于第 一次 给药 后的 第 35d 处死 动物, 取 双侧副睾, 放入盛有少量生理盐水 的平皿中, 将 副睾剪碎, 经血滤网过滤, 滤液直接涂片, 自然 干燥后, 用甲 醇固定, 2% 伊红染色、每鼠计数 1000 个完整精子, 记录畸变精子类 型与数目, 计算精子畸形率 ( % ) 。 5 统计 学方法 Ames 试 验用 方差 分析, 小 鼠骨髓 微核 试 验结果用 x2 检验, 小鼠精子畸形试验用秩和检验。
3 小鼠骨髓微核试验 各剂量组微 核发生率与 阴性对照 组 比较, 差异无统计学 意义 ( P > 01 05) , 阳 性对 照组 明显 高 于阴性对照组 ( P < 0101) 。提 示对 微核形 成及 PCE/ RBC 比 值无明显影响, 见表 2。
表 2 小鼠骨髓微核试验结果
性别
剂量 PCE
参考文献
[1] 俞萍, 徐德 洲. 蝙蝠 蛾 被毛 孢 菌 丝体 改 善 小鼠 睡 眠 的 作 用 [ J] . 中国医院药学杂志. 2006, 26 ( 9) : 1179~ 1180.
[ 2] 卫生部. 5保健食品检验与评价技术规范6 [ S] . 2003. [3] 黄幸 纾, 陈 星若. 环 境化学 物致 突变、致 畸、致 癌试 验方 法
1, 8- 二羟基蒽醌 ( 50)
表 1 蝙蝠蛾被毛孢虫草菌丝体粉 Ames 试验结果
- S9
TA 97
+ S9
1281 3 ? 71 5 1501 7? 416
1381 7 ? 1312 1461 3? 418
1291 3 ? 1514 1461 3? 610
1341 3 ? 1519 1381 7? 171 0
# 92 #
浙江预防医学 2008 年第 20 卷第 6 期 Zhejiang Prev M ed, June 2008, Vol 20, No1 6
#实验技术#
蝙蝠蛾被毛孢虫草菌丝体粉急性 毒性和致突变作用
查捷 项华 孙建荣 章晓玲 金慧
中图分类号: R-332 文献标识码: B 文章编号: 1007-0931 ( 2008) 06-0092-02
( g / kg)
雄性 蝙蝠蛾粉
215 5000
510 5000
1010 5000
阴性 ( H2O)
5000
环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
5000
雌性 蝙蝠蛾粉
215 5000
510 5000
1010 5000
阴性 ( H2O)
5000
环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
5000
MN/ MN PCE
PCE ( j ) / NCE
24917 ? 121 5 2641 3 ? 1213
25210 ? 61 5 2631 7 ? 51 9
25810 ? 91 8 2641 0 ? 1118
25610 ? 91 2 2651 0 ? 51 1
25410 ? 151 0 2651 3 ? 81 3
235010 ? 8010 22101 0 ? 1101 0
3113 ? 211 3513 ? 11 3 1521 3 ? 1613 15613 ? 714
1351 7 ? 1116 1411 0? 715
3313 ? 112 3417 ?ຫໍສະໝຸດ Baidu11 9 1471 3 ? 1613 1521 0? 121 8
1311 3 ? 91 0 1391 3? 910 22401 0 ? 9910
[ M] . 杭州: 浙江科学技术出版社, 1985. 13~ 41. [ 4] 李连德, 李增智, 樊美珍, 等. 虫草多糖 研究进展 [ J] . 安 徽
农业大学学报, 2000, 27 ( 4) : 413~ 416. ( 收稿日期: 2007-08-20)
从上个世纪 80 年代起, 我国 研究人员 就冬虫 夏草的 菌 种分离、人工培养和发 酵制 药等 方面开 展了 大量的 研究 工 作。蝙蝠蛾被毛孢就是 由青 海畜 牧兽医 科学 院有关 人员 于 1983 年自冬虫 夏草中 分离 而得到 的。本研 究采 用大、小 鼠 急性 毒性试验、Ames 试 验、骨髓微 核试验 和小鼠 精子畸 形 试验 4 种方法 , 分别 从急性 毒性、 基因 突变、 体细 胞和 生 殖细胞、体内和体 外、真核和 原核 细胞 方面对 以人 工发 酵 工艺 生产的蝙蝠蛾被毛 孢虫 草菌 丝体粉 的急 性毒性 和致 突 变性 进行了评价。 结果表 明该 产品对 大、小鼠 急性 毒性 属 无毒级, 对原核生 物未显 示出 致突变 性, 对哺 乳动 物体 细 胞和生殖细胞亦无致突变性。
浙江预防医学 2008 年第 20 卷第 6 期 Zhejiang Prev Med, June 2008, Vol 20, No16
# 93 #
剂量 ( Lg/ 皿)
5000
1000
蝙蝠蛾 粉
200
40
8 阴性 ( H2O ) 9- AA ( 50) 2, 7- AF ( 20) NaN 3 ( 115) MMC ( 01 5) 2AF ( 10)
9
118 1101
8
116 1100
10 210 1102
9
118 0196
244 4818* 0191
7
114 1102
8
116 1102
8
116 0199
8
116 0198
158 3116* 0189
* 与阴性组比较, P < 01 05
4 小鼠精子畸形试验 各个剂量组 精子畸形率 与阴性对 照
回变菌落数 ( x ? SD)
- S9
TA98
+ S9
TA100
- S9
+ S9
3113 ? 211 3910 ? 21 2
1541 0? 616 15810 ? 316
3117 ? 211 3717 ? 0147 1571 5 ? 1314 15613 ? 617
3310 ? 216 3813 ? 21 4 1531 7 ? 1413 16010 ? 512
3117 ? 115 3417 ? 11 7 99910 ? 291 7
1471 2 ? 1215 15510 ? 517 21551 0? 771 8
25451 0? 2551 0
24801 0 ? 7010
24401 0? 12010
T A102
- S9
+ S9
26313 ? 71 4 2701 0 ? 1611
组比较, 差异无统计 学意 义 ( P > 0105) , 而阳 性对 照组 明 显高于阴性对照 组 ( P < 0105) 。提 示对 精子 无明显 致畸 形
作用, 见表 3。
表 3 小鼠精子畸形试验结果
剂量 ( g/ kg)
观察精子数 畸形数 畸形率 ( % )
蝙蝠蛾粉 21 5 51 0
1010 阴性 ( H2O ) 01 1ml / 10g 环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
冬虫夏草是我 国名贵 的滋 补纯化 中药, 被誉为 中国 中 药三大宝之一。但由于受生长条件 的限制, 天然资 源稀缺, 现多采用人 工方法分离 和培 育功效 菌种 来获 得冬虫 夏草 的 替代品。蝙 蝠蛾 被毛孢 虫草 菌丝体 粉 ( 蝙 蝠蛾粉 ) 就是 以 人工发酵工艺生产 而取得 的冬 虫夏草 替代 品, 对小 鼠具 有 一定 的 改 善 睡 眠 作 用[1] 。为 了 解 其 毒 性作 用, 我 们 依 据 5 保健食品检验与评价技术规范6 2003 年版[ 2] 要 求分别对 其 进行了急性毒性和致突变性的研究。
结果
1 最大耐受剂量 蝙蝠蛾被毛 孢虫草菌丝 体粉大、小鼠 急 性毒性试 验结 果, 大、小鼠 经口 灌胃给 予样 品后, 在观 察 期内未出现异常症 状和死 亡情 况。得蝙 蝠蛾 被毛孢 虫草 菌 丝体粉雌雄大、小鼠 LD50体重均大于 2010g/ kg, 根据 5 保健 食品检验与评价技术规范6 ( 2003) , 为无毒级。 2 Ames 试验 蝙蝠 蛾被毛 孢虫 草菌丝 体粉 各剂量 组在 加 和不加 S9 条件 下, 回变 菌落数均 未超过 阴性对 照组的 2 倍 以上, 本试验结果显示该样品 Ames 试验结 果为阴性。见 表 1。
5000
77 1154
5000
75 1150
5000
89 1178
5000
61 1122
5000
287
5174*
* 与阴性组比较, P < 01 05。
讨论
冬虫夏草 的药用 价值 早已为 世人 所公认, 它还 具有 抗 肿瘤抗辐射作用[ 4] 。近年来, 随着人 们逐 渐发 现和 认识 虫 草的药补疗效和提 高免疫 功能, 虫草的 开发 受到了 众人 极 大的关注。人们相 继开发 了各 种虫草 替代 品, 蝙蝠 蛾被 毛 孢虫 草菌丝体粉就是经 人工 发酵 工艺生 产的 一种冬 虫夏 草 替代品。
材料与方法
1 受试物 蝙蝠 蛾被 毛 孢虫 草 菌丝 体粉 为 微黄 色粉 末 状 ( 杭州赐富生物技术有限公司提供, 批号 20040906) 。 2 实验动物 清 洁级 ICR 种 小鼠、SD 大 鼠均 由浙 江省 实 验动物中 心提 供。实 验 动物 许可 证 号为 SCXK ( 浙 ) 2003000 1。 3 试 验 菌株 Ames 试 验 采用 鼠 伤 寒 沙门 菌 突 变 型 菌 株 TA97、TA98 、TA100、TA102及 S9 均 由上 海 复旦 大 学医 学 院 提 供。 4 实验方法 411 最大耐受量试验 选用 ICR 小鼠 20 只, 体重 18~ 20g; SD 大鼠 20 只 , 体重 180~ 220g; 均雌 雄各 半。样品 配制 剂 量为 5g/ 10ml, 2 次/ d 灌胃, 每次间隔 4h。按急 性毒性分 级 检验, 无毒级试 验剂 量 2010g / kg1bw 给 予后观 察 14d, 记 录 中毒表现及死亡情况。 412 Ames 试 验 选 用 鼠 伤 寒 沙 门 菌 突 变 型 菌 株 TA97、 TA98、TA100、TA102 作 为 测试 菌株。 阳性 对 照为 9-AA ( 9- 氨 基口丫 啶) 、2, 7-AF ( 2, 7- 二 氨 基 芴) 、NaN3 ( 叠 氮 钠 ) 、 MMC ( 丝裂 霉素 C) 、2AF ( 二氨 基芴) 、1, 8- 二 羟基 蒽醌, 同时设阴性对 照 ( 蒸 馏水) 和 空白 对照。受 试物蝙 蝠蛾 被 毛孢虫草菌 丝体 粉 设 5 个 剂 量, 分 别为 5000、1000、200、
40、8Lg/ 皿。在加和不加 S9 混合 液的条 件下 采用平 板掺 入 法进行试验[3] , 每剂量做 3 皿, 重复 2 次。 413 小 鼠骨 髓细 胞 微核 试 验 选 用体 重 25~ 30g 清 洁 级 ICR 小鼠 50 只, 随机分为 5 组, 每组 10 只, 雌雄各半 。设 101 0、510、215g/ kg# bw 3 个 剂量 组, 并 设阴 性 对照 组 ( 蒸 馏水) 、阳性对照组 ( 环磷酰胺 40mg/ kg#bw) 。各组均按 30h 给受 试物法给药, 2 次给受 试物间 隔 24h。第 2 次 给受试 物 后 6h 处死动物, 取股骨骨 髓常规制片。每鼠镜检 1000 个 骨 髓嗜 多染红细胞 ( PCE) , 并计 算微 核发生 率, 以千 分率 表 示。每鼠计数 200 个 嗜多 染红 细胞, 并计 算嗜 多染 红细 胞 与成熟红细胞比值 ( PCE/ RBC) 。 414 小鼠精子 畸形试验 选用体重 25~ 30g 雄 性 ICR 小 鼠 25 只, 随即分为 5 组, 每 组 5 只。设 1010、510、215 g/ kg# bw 3 个剂量组, 并 设阴性 对照 组 ( 蒸 馏水) 和阳性 对照 组 ( 环磷酰胺 40mg/ kg# bw) 。各组 动物均采 用经口 灌胃连 续 5d 定时给药, 各组均 于第 一次 给药 后的 第 35d 处死 动物, 取 双侧副睾, 放入盛有少量生理盐水 的平皿中, 将 副睾剪碎, 经血滤网过滤, 滤液直接涂片, 自然 干燥后, 用甲 醇固定, 2% 伊红染色、每鼠计数 1000 个完整精子, 记录畸变精子类 型与数目, 计算精子畸形率 ( % ) 。 5 统计 学方法 Ames 试 验用 方差 分析, 小 鼠骨髓 微核 试 验结果用 x2 检验, 小鼠精子畸形试验用秩和检验。
3 小鼠骨髓微核试验 各剂量组微 核发生率与 阴性对照 组 比较, 差异无统计学 意义 ( P > 01 05) , 阳 性对 照组 明显 高 于阴性对照组 ( P < 0101) 。提 示对 微核形 成及 PCE/ RBC 比 值无明显影响, 见表 2。
表 2 小鼠骨髓微核试验结果
性别
剂量 PCE
参考文献
[1] 俞萍, 徐德 洲. 蝙蝠 蛾 被毛 孢 菌 丝体 改 善 小鼠 睡 眠 的 作 用 [ J] . 中国医院药学杂志. 2006, 26 ( 9) : 1179~ 1180.
[ 2] 卫生部. 5保健食品检验与评价技术规范6 [ S] . 2003. [3] 黄幸 纾, 陈 星若. 环 境化学 物致 突变、致 畸、致 癌试 验方 法
1, 8- 二羟基蒽醌 ( 50)
表 1 蝙蝠蛾被毛孢虫草菌丝体粉 Ames 试验结果
- S9
TA 97
+ S9
1281 3 ? 71 5 1501 7? 416
1381 7 ? 1312 1461 3? 418
1291 3 ? 1514 1461 3? 610
1341 3 ? 1519 1381 7? 171 0
# 92 #
浙江预防医学 2008 年第 20 卷第 6 期 Zhejiang Prev M ed, June 2008, Vol 20, No1 6
#实验技术#
蝙蝠蛾被毛孢虫草菌丝体粉急性 毒性和致突变作用
查捷 项华 孙建荣 章晓玲 金慧
中图分类号: R-332 文献标识码: B 文章编号: 1007-0931 ( 2008) 06-0092-02
( g / kg)
雄性 蝙蝠蛾粉
215 5000
510 5000
1010 5000
阴性 ( H2O)
5000
环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
5000
雌性 蝙蝠蛾粉
215 5000
510 5000
1010 5000
阴性 ( H2O)
5000
环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
5000
MN/ MN PCE
PCE ( j ) / NCE
24917 ? 121 5 2641 3 ? 1213
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25810 ? 91 8 2641 0 ? 1118
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25410 ? 151 0 2651 3 ? 81 3
235010 ? 8010 22101 0 ? 1101 0
3113 ? 211 3513 ? 11 3 1521 3 ? 1613 15613 ? 714
1351 7 ? 1116 1411 0? 715
3313 ? 112 3417 ?ຫໍສະໝຸດ Baidu11 9 1471 3 ? 1613 1521 0? 121 8
1311 3 ? 91 0 1391 3? 910 22401 0 ? 9910
[ M] . 杭州: 浙江科学技术出版社, 1985. 13~ 41. [ 4] 李连德, 李增智, 樊美珍, 等. 虫草多糖 研究进展 [ J] . 安 徽
农业大学学报, 2000, 27 ( 4) : 413~ 416. ( 收稿日期: 2007-08-20)
从上个世纪 80 年代起, 我国 研究人员 就冬虫 夏草的 菌 种分离、人工培养和发 酵制 药等 方面开 展了 大量的 研究 工 作。蝙蝠蛾被毛孢就是 由青 海畜 牧兽医 科学 院有关 人员 于 1983 年自冬虫 夏草中 分离 而得到 的。本研 究采 用大、小 鼠 急性 毒性试验、Ames 试 验、骨髓微 核试验 和小鼠 精子畸 形 试验 4 种方法 , 分别 从急性 毒性、 基因 突变、 体细 胞和 生 殖细胞、体内和体 外、真核和 原核 细胞 方面对 以人 工发 酵 工艺 生产的蝙蝠蛾被毛 孢虫 草菌 丝体粉 的急 性毒性 和致 突 变性 进行了评价。 结果表 明该 产品对 大、小鼠 急性 毒性 属 无毒级, 对原核生 物未显 示出 致突变 性, 对哺 乳动 物体 细 胞和生殖细胞亦无致突变性。
浙江预防医学 2008 年第 20 卷第 6 期 Zhejiang Prev Med, June 2008, Vol 20, No16
# 93 #
剂量 ( Lg/ 皿)
5000
1000
蝙蝠蛾 粉
200
40
8 阴性 ( H2O ) 9- AA ( 50) 2, 7- AF ( 20) NaN 3 ( 115) MMC ( 01 5) 2AF ( 10)
9
118 1101
8
116 1100
10 210 1102
9
118 0196
244 4818* 0191
7
114 1102
8
116 1102
8
116 0199
8
116 0198
158 3116* 0189
* 与阴性组比较, P < 01 05
4 小鼠精子畸形试验 各个剂量组 精子畸形率 与阴性对 照
回变菌落数 ( x ? SD)
- S9
TA98
+ S9
TA100
- S9
+ S9
3113 ? 211 3910 ? 21 2
1541 0? 616 15810 ? 316
3117 ? 211 3717 ? 0147 1571 5 ? 1314 15613 ? 617
3310 ? 216 3813 ? 21 4 1531 7 ? 1413 16010 ? 512
3117 ? 115 3417 ? 11 7 99910 ? 291 7
1471 2 ? 1215 15510 ? 517 21551 0? 771 8
25451 0? 2551 0
24801 0 ? 7010
24401 0? 12010
T A102
- S9
+ S9
26313 ? 71 4 2701 0 ? 1611
组比较, 差异无统计 学意 义 ( P > 0105) , 而阳 性对 照组 明 显高于阴性对照 组 ( P < 0105) 。提 示对 精子 无明显 致畸 形
作用, 见表 3。
表 3 小鼠精子畸形试验结果
剂量 ( g/ kg)
观察精子数 畸形数 畸形率 ( % )
蝙蝠蛾粉 21 5 51 0
1010 阴性 ( H2O ) 01 1ml / 10g 环磷酰胺 ( 40mg/ kg)
冬虫夏草是我 国名贵 的滋 补纯化 中药, 被誉为 中国 中 药三大宝之一。但由于受生长条件 的限制, 天然资 源稀缺, 现多采用人 工方法分离 和培 育功效 菌种 来获 得冬虫 夏草 的 替代品。蝙 蝠蛾 被毛孢 虫草 菌丝体 粉 ( 蝙 蝠蛾粉 ) 就是 以 人工发酵工艺生产 而取得 的冬 虫夏草 替代 品, 对小 鼠具 有 一定 的 改 善 睡 眠 作 用[1] 。为 了 解 其 毒 性作 用, 我 们 依 据 5 保健食品检验与评价技术规范6 2003 年版[ 2] 要 求分别对 其 进行了急性毒性和致突变性的研究。
结果
1 最大耐受剂量 蝙蝠蛾被毛 孢虫草菌丝 体粉大、小鼠 急 性毒性试 验结 果, 大、小鼠 经口 灌胃给 予样 品后, 在观 察 期内未出现异常症 状和死 亡情 况。得蝙 蝠蛾 被毛孢 虫草 菌 丝体粉雌雄大、小鼠 LD50体重均大于 2010g/ kg, 根据 5 保健 食品检验与评价技术规范6 ( 2003) , 为无毒级。 2 Ames 试验 蝙蝠 蛾被毛 孢虫 草菌丝 体粉 各剂量 组在 加 和不加 S9 条件 下, 回变 菌落数均 未超过 阴性对 照组的 2 倍 以上, 本试验结果显示该样品 Ames 试验结 果为阴性。见 表 1。
5000
77 1154
5000
75 1150
5000
89 1178
5000
61 1122
5000
287
5174*
* 与阴性组比较, P < 01 05。
讨论
冬虫夏草 的药用 价值 早已为 世人 所公认, 它还 具有 抗 肿瘤抗辐射作用[ 4] 。近年来, 随着人 们逐 渐发 现和 认识 虫 草的药补疗效和提 高免疫 功能, 虫草的 开发 受到了 众人 极 大的关注。人们相 继开发 了各 种虫草 替代 品, 蝙蝠 蛾被 毛 孢虫 草菌丝体粉就是经 人工 发酵 工艺生 产的 一种冬 虫夏 草 替代品。
材料与方法
1 受试物 蝙蝠 蛾被 毛 孢虫 草 菌丝 体粉 为 微黄 色粉 末 状 ( 杭州赐富生物技术有限公司提供, 批号 20040906) 。 2 实验动物 清 洁级 ICR 种 小鼠、SD 大 鼠均 由浙 江省 实 验动物中 心提 供。实 验 动物 许可 证 号为 SCXK ( 浙 ) 2003000 1。 3 试 验 菌株 Ames 试 验 采用 鼠 伤 寒 沙门 菌 突 变 型 菌 株 TA97、TA98 、TA100、TA102及 S9 均 由上 海 复旦 大 学医 学 院 提 供。 4 实验方法 411 最大耐受量试验 选用 ICR 小鼠 20 只, 体重 18~ 20g; SD 大鼠 20 只 , 体重 180~ 220g; 均雌 雄各 半。样品 配制 剂 量为 5g/ 10ml, 2 次/ d 灌胃, 每次间隔 4h。按急 性毒性分 级 检验, 无毒级试 验剂 量 2010g / kg1bw 给 予后观 察 14d, 记 录 中毒表现及死亡情况。 412 Ames 试 验 选 用 鼠 伤 寒 沙 门 菌 突 变 型 菌 株 TA97、 TA98、TA100、TA102 作 为 测试 菌株。 阳性 对 照为 9-AA ( 9- 氨 基口丫 啶) 、2, 7-AF ( 2, 7- 二 氨 基 芴) 、NaN3 ( 叠 氮 钠 ) 、 MMC ( 丝裂 霉素 C) 、2AF ( 二氨 基芴) 、1, 8- 二 羟基 蒽醌, 同时设阴性对 照 ( 蒸 馏水) 和 空白 对照。受 试物蝙 蝠蛾 被 毛孢虫草菌 丝体 粉 设 5 个 剂 量, 分 别为 5000、1000、200、