青霉素发酵培养基正交优化试验_百替生物

实验五青霉素发酵培养基正交优化试验

[实验目的]

1、掌握培养基的原理

2、了解培养基优化的原理和试验设计方法

3、通过实验确定青霉素发酵的较适培养基

[实验原理]

1、掌握培养基的原理

a碳源、氮源

许多碳源和氮源都是复杂的有机物大分子,如淀粉、黄豆饼粉等,用这类原料作为培养基时,微生物必须要具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力,但不是所有的微生物都具备这种能力的.

相应的酶水解/葡萄糖:成本高

b代谢的阻遏和诱导

碳源、氮源:根据微生物的特性和培养的目的,注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合

葡萄糖:具体利用葡萄糖产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性.

氮源的诱导或阻遏:蛋白酶类,受培养基中蛋白质或多肽的诱导,而受铵盐、硝酸盐的阻遏;应以有机氮源为主

c合适的C、N比

碳氮:过多则容易形成较低的pH;不足则容易引起菌体的衰老和自溶，显著影响微生物生长繁殖和产物合成。

氮源:过多,菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累;不足则菌体繁殖量少,从而影响产量。

碳氮比:菌丝体生长阶段氮源需求高;孢子生长阶段氮源需求低.100:(0.2~2.0)

d pH的要求

微生物在利用营养物质后,由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体

系的pH的波动.因而在配制培养基选取营养成分时,除了要考虑营养的需求外,还要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲体系的影响

2、培养基优化的原理和试验设计方法

a培养基优化的基本原理

一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段。

第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成。

第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。

b实验设计方法

单因子实验确定培养基的成分：多因子实验确定各成分对培养基的影响大小及适宜浓度

多因子:通过较少的实验次数获得所需的结果,正交实验设计、相应面分析等

为了追求可比性，正交表中的每个水平都要有适当的重复。正交实验所需的实验次数（NL）是有实验需要的水平数（q）决定的：NL＝nq2。n为自然数。

正交表具有3个主要特点：（1）任何两因素之间的都是全面实验，从而保持了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了，并且出现了相同的次数。（2）任一因素个水平的重复次数相等。（3）绝大多数正交表中各列是等价的，可以任意取用。因此，正交表的实验结果非常易于分析，以至于不需要进行复杂的统计计算，就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。

正交实验:

1、根据问题的要求确定因子和水平,列出因子水平表

2、根据因子和水平数选用合适的正交表,设计表头,安排实验

3、根据正交表给出的实验方案,进行实验

4、对实验结果进行分析,选出较优的“实验条件”以及对结果有显著影响的因子

[实验材料]

1、菌种:产黄青霉菌(Pencillium chrysogenum);金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus)

2、培养基

发酵培养基:乳糖22.5g,葡萄糖7.5g,醋酸铵8.0g,Na2SO40.5g,MgSO4•7H2O0.25g, FeSO4•7H2O0.1g,CuSO4•5H2O0.005g,MnSO4•7H2O0.02g,CaCl2•2H2O0.05g,ZnSO4•7H2O0.02g,苯乙酸1.0g,蒸馏水1000ml,pH6.5,121℃灭菌20min.

注意:微量元素配成母液,按需要加入,苯乙酸用乙醇溶解后再加入。

3、设备和器皿:摇床,三角瓶,牛津小杯,平皿,离心机,分光光度计,容量瓶等

生物测定培养基:牛肉膏0.5%蛋白胨1%酵母膏0.3%NaCl0.3%琼脂1.5%葡萄糖5% pH6.0121℃灭菌20min需要250ml

4、试剂:1%pH6.0磷酸缓冲溶(K2HPO42g,KH2PO48g,蒸馏水1000ml)；0.85%生理盐水

[操作步骤]

1、发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml。

(三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml三角瓶装液量为50ml)

2、摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基,25℃、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定。

3、金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37℃培养16-18h的斜面菌种,用0.9%的生理盐水洗下，将菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液,需要12ml。

4、生测平板的制备:生测培养基400ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*6+2个平板

5、青霉素发酵液效价的测定:发酵结束后5000rpm离心5min．每个被测样品用3套平皿进行测定；37℃培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小。

6、填写正交实验表格,确定最适培养基配方。

[实验结果与分析]

因子水平表

[实验分析]

1.在试验选择的水平范围内。极差可以直接反映各个因素选取的水平变化对优化目标影响的大小。从本实验各因素极差的比较重，可根据极差的大小顺序排除因素影响的主次顺序，为乳糖/葡萄糖>苯乙酸>醋酸铵

2.试验的目的是产黄曲霉的效价，需要抑菌圈大的。从试验中可以看出乳糖/葡萄糖，苯乙酸，醋酸铵各自在水平一的时候抑菌圈最大。

3.从上图看出3个因素水平在试验范围内都没有极大值，这与理论结果有很大误差，因此还应该开展进一步的试验。