开题报告

[19] LIBEN CHEN, ZHENGFANG WANG, MIRO FERRERI, JINGLIANG SU,* AND BO HAN*. Cephalexin Residue Detection in Milk and Beef by ELISA andColloidal Gold Based One-Step Strip Assay . J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 4674–4679 [20] ELMA E. M. G. LOOMANS,†,‡ JIM VAN WILTENBURG,§ MARJO KOETS,† AND AART VAN AMERONGEN*. Neamin as an Immunogen for the Development of a Generic ELISA Detecting Gentamicin, Kanamycin, and Neomycin in Milk. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 587-593 587 [21] J. D. Thacker,*,† E. S. Casale,† and Cassius M. Tucker Immunoassays (ELISA) for Rapid, Quantitative Analysis in the Food-Processing Industry . J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2680-2685
试剂：磷酸二氢钾，氯化钾，十二水合磷酸氢二钠（AR，分析纯， 试剂：磷酸二氢钾，氯化钾，十二水合磷酸氢二钠（AR，分析纯，
南京化学试剂有限公司），氯化钠（江苏强盛功能化学股份有限公 司），醛基化玻片，银增强显色剂（sigma公司产品），牛血清蛋白 司），醛基化玻片，银增强显色剂（sigma公司产品），牛血清蛋白 (BSA)（sigma公司产品）。20%甘油，tween-20，纯化水，超纯水，抗 (BSA)（sigma公司产品）。20%甘油，tween-20，纯化水，超纯水，抗 生素单克隆抗体（USA，biodesign） 生素单克隆抗体（USA，biodesign）
本课题的研究内容
青霉素检测方法的建立 牛奶中青霉素残留免疫检测法 优化条件： 胶体金的浓度 抗体的浓度 加样浓度 标准曲线的绘制
实验原理
蛋白芯片法测定青霉素残留的基础是抗原 抗体反应。 芯片载体上固定有青霉素残留物的BSA(牛 血清白蛋白)偶联物，然后在反应区域内 加入残留物的单克隆抗体和标准品或样品 的混合物，进行竞争反应，待抗原抗体完 全反应后洗涤，再加入胶体金标记二抗， 最后通过银增强试剂显色，通过扫描来进 行残留量的定量分析。
本课题的国内外研究现状
国外情况： 国外情况：
目前国外对于青霉素类抗生素的残留检测， 大部分是采用免疫分析法，国外已有较多 关于免疫检测青霉素类抗生素的报道并在 此基础上开发了相关免疫试剂盒。如在英 国应用最广泛的免疫试剂盒就是由美国 IDEXX Laboratories公司研发的LacTek法。 Laboratories公司研发的LacTek法。
3、免疫检测法
免疫检测法（IA）是一种利用抗原－抗体反应检测各 免疫检测法（IA）是一种利用抗原－抗体反应检测各 种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的方法。 是近几十年发展起来的新技术，主要包括酶联免疫吸 附法、荧光免疫测定法、固相免疫传感器、胶体会免 疫层析技术、放射免疫法等。目前研究应用较多的是 酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金快速检测试纸条。 酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金快速检测试纸条。 (ELISA) 特点：与传统的微生物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ测法和常规的理化分析方法 特点：与传统的微生物检测法和常规的理化分析方法 相比 ,免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快， 高通量，并行性，灵敏度高，特异性强，可视化，无 需任何昂贵的仪器，费用低。
实验方法及步骤
1、点样：青霉素-BSA偶联蛋白 点样：青霉素-BSA偶联蛋白 2、固定： 4℃过夜 或37 ℃ 2h 固定： 3、封闭: 10mg/ml BSA 1h 封闭: 4、加抗青霉素抗体和标准品或样品的混合物 5、胶体金标记二抗: 羊抗鼠抗体-胶体金 胶体金标记二抗: 羊抗鼠抗体6、银增强剂显色： 银离子被催化为黑色的银 银增强剂显色： 7、扫描及数据分析
参考文献
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国内情况： 国内情况：
我国国标还是采用微生物检测的TTC法 我国国标还是采用微生物检测的TTC法，理化检 测法只在一些有条件的实验室或国家检测机构使 而免疫分析残留检测还刚起步， 用，而免疫分析残留检测还刚起步，正在在建立 过程中。免疫层析检测技术（如胶体金试纸条） 过程中。免疫层析检测技术（如胶体金试纸条） 已成为中国快速诊断试剂产业服务商的第一品牌， 已成为中国快速诊断试剂产业服务商的第一品牌， 但目前免疫胶体金主要用于人医临床和兽医传染 病的诊断， 病的诊断，在抗生素残留检测上的运用并不十分 广泛，因此加强这方面的开发，前景可观。 广泛，因此加强这方面的开发，前景可观。
本课题的创新之处： 本课题的创新之处：
本课题采用的是生物微阵列芯片技术，基 于竞争免疫反应原理的蛋白芯片，通过免 竞争免疫反应原理的蛋白芯片，通过免 疫胶体金标记检测青霉素（AMP） 疫胶体金标记检测青霉素（AMP）,这是一 种新颖的方法 高通量 并行性 灵敏度高，特异性强 快速检测 可视化 无需任何昂贵的仪器费用低
检测方法
1、微生物法： 微生物法：
微生物法是检测抗生素残留的最传统的方法，其测定原 理是：根据抗生素对微生物的生理机能、代谢等的抑制 作用，来定性或定量检测样品中抗生素残留的研究方法。 如TTC法、纸片法(PD)杯碟法（CP）等。 TTC法、纸片法(PD)杯碟法（CP）等。 特点：微生物法易受组织中其他抗生素的影响,特异性低, 特点：微生物法易受组织中其他抗生素的影响,特异性低, 灵敏度也不高,但操作简便,样品用量少,预处理简单, 灵敏度也不高,但操作简便,样品用量少,预处理简单,在基 层大规模筛选工作中有很大的应用价值。
实验仪器与试剂
实验仪器：中晶扫描仪（型号：Artixscan 1100 plus，上海），数 中晶扫描仪（型号：Artixscan plus，上海），数
显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），Lx-100手掌型离心机 显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），Lx-100手掌型离心机 （江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司），单道可调移液器 （江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司），单道可调移液器（百得 单道可调移液器（百得 实验室仪器苏州有限公司），枪头 实验室仪器苏州有限公司），枪头
2、理化检测法
理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有 的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色 谱法、气相色谱法、质谱法、比色法、荧光分光 光度法、联用技术等等。 特点： 特点：这类方法中大多既能进行定性分析，也能 进行定量检测，而且检测速度快，灵敏度、特异 性、分辨率均很高，重复性好，应用广泛。但是 其检测要求高、需要昂贵的检测设备、检测程序 较复杂、检测费用较高，一般应用于科研，很难 在基层推广应用。
牛奶中青霉素免疫检测法的建立
报告人：孙艳艳 指导老师：李周敏
青霉素残留的危害
1、人体长期摄入含少量抗生素残留的动物性食品 可造成药物积累，当达到一定浓度后， 后，可造成药物积累，当达到一定浓度后，就会 产生毒性作用； 产生毒性作用； 2、发生过敏反应； 发生过敏反应； 3、致癌、致畸、致突变等作用； 致癌、致畸、致突变等作用； 4、促使病原菌产生耐药性； 促使病原菌产生耐药性； 5、抑制胃肠道菌群的产生； 抑制胃肠道菌群的产生； 6、对环境的生态毒理性等。 对环境的生态毒理性等。 因此，国家对抗生素含量限制有很明确的规定， 因此，国家对抗生素含量限制有很明确的规定， 并建立了几种简便的检测方法。 并建立了几种简便的检测方法。
溶液：PBS:(氯化钠40g，氯化钾1g，磷酸二氢钾1g，十二水合磷酸 溶液：PBS:(氯化钠40g，氯化钾1g，磷酸二氢钾1g，十二水合磷酸
氢二钠18.1g，纯化水500ml)，封闭缓冲液：（含1%BSA(10mg/ml)的 氢二钠18.1g，纯化水500ml)，封闭缓冲液：（含1%BSA(10mg/ml)的 PBS溶液），抗生素及抗体稀释液：（1mg/ml BSA稀释，1mg/ml PBS溶液），抗生素及抗体稀释液：（1mg/ml BSA稀释，1mg/ml BSA 用PBS稀释），洗涤液PBST：(含0.05%吐温-20的PBS溶液，即1000ml PBS稀释），洗涤液PBST： 0.05%吐温-20的PBS溶液，即1000ml PBS中加入500ul吐温PBS中加入500ul吐温-20)