DNA序列分析PPT课件

Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法基本 步骤
➢待测DNA与pBR322或pUC分子重组； ➢转化：转化反应物涂布在补加有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，经37℃
过夜培养；
➢挑选白色菌落，制备质粒NA。 ➢碱变性处理，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。
优点：无需将DNA克隆到M13载体上，更为简单快速，现已被许多研究工 作者采用。
M13载体克隆DNA片段
➢ 将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于 Lac区段 中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。
➢ 重组体噬菌体，在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色 的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。
➢ 从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA， 就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。
➢ 当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列 拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。
使用M13载体系列的优点
所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免 了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。
最初使用的引物，是克隆在PBR322质粒载体上的一种短的限制片 段。以后J．Messing等人（1981）发展出了一种更加适用的长度为 15bp的合成引物，这段引物同M13的其它位点之间有低度的同源性， 后来又合成出了改进的同M13其它任何位点均无同源性的引物。
1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核 苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解 成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。
引物—延伸测序策略
➢1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．Ray Wu） 独创性地
现在，应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最 普遍采用的快速的DNA序列分析法。
Sanger 双脱氧一pUC体系 DNA序列分析法
自引入M13载体系列，DNA序列分析又有了新的改良和发展。 ➢起初是使用Klenow片段，现在则可以使用反转录酶或T7DNA聚合酶。 ➢以往都是把待测DNA片段克隆到M13mp载体上，得到单链模板后， 再按双脱氧链终止法进行序列分析。现在，可以将待测DNA片段克隆 到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作 DNA 序 列 分 析 。 这 种 方 法 特 称 为 利 用 双 链 质 粒 DNA 模 板 的 双 脱 氧 DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称 之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。
ddATP ddTTPddGTP ddCTP
G ddCTP ddATP ddGTP ddTTP
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A
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Sanger双脱氧-M13体系 DNA序列分析法
引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷
高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或 聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。
尔奖。
Sanger双脱氧链终止法原理
利用DNA聚合酶的两种酶 催反应特性：
1 、 利 用 单 链 DNA 模 板 ， 合成DNA互补链；
2、利用2’,3’双脱氧核苷三 磷酸作底物，参入到寡核 酸链的末端，从而终止 DNA链的生长。
有时也称引物合成法，或 酶催引物合成法。
将待测DNA制备成单链分子作为模板；人工合成的寡核苷酸 链作为引物；引物进行放射性核素标记；退火后模板—引物 结合。
Maxam－Gilbert化学修饰法
是 1 9 7 7 年 由 美 国 哈 佛 大 学 的 A．M．Maxam 和 W． Gilbert 发 明 的 ， 所 以 又 叫 做 Maxam－Gilbert DNA序列分析法 虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言， 化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度 也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中 仍被采用。
反应：上述混合液分为4个反应管，每个管中加入DNA聚合 酶1、各一种ddNTP、以及四种dNTP（32P dATP为放射性标 记）。
引物延伸反应终止后加热变性分离核素标记的单链DNA分子， 凝胶电泳分离反应混合物。
放射自显影术，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸 顺序。（*此顺序与测序链的核酸顺序为互补。）
设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了 λ噬菌体两个COS末端的完整序列；
➢1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； ➢M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝
为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或 数种内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。
这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分 离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。 为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步 骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤 和丢失。
DNA核酸序列分析
➢ Sanger双脱氧链终止法 ➢ Maxam－Gilbert化学修饰法 ➢ 杂交测序
Sanger双脱氧链终止法
DNA核酸序列分析历程
60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研 究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。
第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋 白质序列分析的束缚。
克服缺点的一种途径—DNA分子克隆
将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子 上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如 M13作为载体，重组体 噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。
引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA 中分离出来的一种限制片段。其优点是能够特异性地同载体分 子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物” 。