玉米19kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建

随着植物基因工程的不断完善，人们需要目的 基因准确高效地在受体植物特定部位表达，但组成 型启动子使基因表达分散而造成目标部位表达量 不足，难以满足要求，因此克隆专一的组织特异性 启动子成为目前植物基因工程研究的重点［1］。 玉米 醇溶蛋白是玉米种子贮藏蛋白的主要成分，占总蛋 白的 50％～60％。 根据醇溶蛋白一级结构的相似性
2． Biology Institute of Shandong Academy of Sciences ／ Key Laboratory for Applied Microbiology of Shandong Province ， Jinan 250014， China）
Abstract： The 19 kD zein（ze19）promoter was amplified from the genomic DNA of maize inbred line 9801， and the sequence was linked to vector pMD18－T． Sequence analysis indicated that the cloned sequence shared 94％ homology with the published sequence． The cloned promoter contains the two basic promoter element， TATA box and CAAT box， and several cis－ regulatory elements， such as GCN4 motif， skn－1 motif， prolamin box，－300 element， which were necessity for mediating endosperm expression of maize zein． By replacing the 35 S promoter， ze19 promoter was inserted upstream of the β －glucuronidase （gus） reporter gene in plasmid pBI121； and the plant expression vector pBIze19 was constructed． Then tobacco were transformed via Agrobacterium tumefacients mediated procedure， thus a foundation for further research about tissue－specific expression of ze19 promoter was laid． Key words： ze19 promoter； Agrobaterium tumefacients mediated procedure； plant expression vector
将 重 组 质 粒 pMD18－ze19 和 pBI121－gus 分 别 用 Hin dⅢ和 Bam HⅠ进行双酶切，在 T4 DNA 连接 酶作用下，16 ℃连接反应过夜， 连接反应产物转化 大肠杆菌 TOP10 感受态细胞， 利用 PCR 及酶切方 法筛选阳性转化子，并进行测序鉴定，得到植物表 达载体 pBI ze19－gus，表达载体构建过程如图 1 所示。 1．4 土壤杆菌介导的烟草转化
Hin dⅢ
35S prom Bam HⅠ
Ze19 序列
Hin dⅢ
Bam HⅠ
origin RB
NOS prom
pBIze19 15 383 bp
NPTⅡ NOS term
LB NOS
GUS
Hin dⅢ ze19 prom Bam HⅠ
图 1 重组载体构建过程
载 体 pBI 121－gus 中 gus 基 因 上 游 含 有 35 S 启 动 子，因此将其转入土壤杆菌，作为分 析 ze19 启动子 活性时的阳性对照，设计 gus 部分基因（约 500 bp） 的引物（P1：5′GGGATCCATCGCAGCGTAATG3′；P2： 5′GCCGACAGCAGCAGTTTCATC3′） 对其进行 PCR 鉴定。
将克隆的 ze19 启动子取代质粒 pBI121 中的 35 S 启动子， 成功构建了由 ze19 启动子驱动 gus 报告基因
的植物表达载体 pBIze19。 利用土壤杆菌介导法将构建好的重组质粒 pBIze19 转入烟草中，为进一步研究
该启动子组织特异性表达奠定了基础。
关键词：ze19 启动子；土壤杆菌介导法；植物表达载体
2 结果与分析
2．1 ze19 启动子的扩增、克隆和序列分析 以玉米自交系 9801 基因组 DNA 为模板，根据
ห้องสมุดไป่ตู้
收 稿 日 期 ：2010－12－17 基 金 项 目 ：山 东 省 科 技 攻 关 课 题 （2009GG10009012 ） 作 者 简 介 ：李 慧 伦 （1984－ ），女 ，河 南 许 昌 人 ，在 读 硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 为 转 基 因 植 物 ，（电 话 ）13518617509 ，0531－88728276 （电 子 信 箱 ）
可分为 α、β、γ、δ 4 种， 其中 α－醇溶蛋白 由 25～50 个基因组成的基因家族编码， 包括 19 kD 和 22 kD 的醇溶蛋白。 由于玉米醇溶蛋白基因的表达具有严 格的时空特异性，在种子发育过程中，其表达严格 限定在胚乳组织中，一般授粉后 10～12 d 开始表达［2］， 因此本实验从玉米基因组中克隆了 19 kD 醇溶蛋白 基因（ze19）的启动子序 列，对其结构 和功能进行 分
采 用 液 氮 冻 融 法 将 重 组 植 物 表 达 载 体 pBI ze19－gus 转入土壤杆菌 LBA4404 中，采用碱裂解法［5］ 提取重组土壤杆菌的质粒，PCR 鉴定转化子。 表达
origin
RB NOS prom
pBI121 14 758 bp
NPTⅡ NOS term
LB
NOS GUS
均来自山东省农业科学院高新技术中心。 大肠杆菌 TOP10、土壤杆菌 LBA440、植物表达载体 pBI121 均 由山东省科学院中日友好生物技术研究中心保存， 克隆载体 pMD18－T、各种限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自 Takara 公司，其他化学试剂为国产分析 纯，PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公 司合成。 1．2 启动子的 PCR 扩增与克隆
以 玉 米 自 交 系 品 种 9801 幼 苗 为 材 料 ， 利 用 CTAB 法 ［3］提 取 玉 米 基 因 组 DNA。 根 据 Giovinazzo 等 ［4］ 发 表 的 ze19 启 动 子 序 列 （GenBank 登 录 号 为 x63667），设计一对特异引物 P1：5′ACGAAGCTTAA CAGACCCGCCTCA3′（划线部分为 引 入 的 Hin d Ⅲ 酶切位点）；P2：5′ACGGGATCCATTGTTGGTACACT A 3′（划 线 部 分 为 引 入 的 Bam HⅠ酶 切 位 点 ）。 以 9801 玉米基因组 DNA 为模板， 扩增该基因起始密 码子上游约 1 400 bp 的调控序 列。 PCR 体系为 50 μL， 包 括 10 ×Buffer 5 μL，10 μmol ／ L P1 2 μL，10 μmol ／ L P2 2 μL，10 mmol ／ L dNTPs 1．2 μL， 基因组 DNA 模 板 1 μL，Taq 酶 0．5 μL，ddH2O 38．3 μL。 PCR 反 应 程 序 为 ：94 ℃ 预 变 性 ，5 min；94 ℃ 变 性 1 min，50 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 90 s，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。
挑取土壤杆菌阳性重组子于含抗生素（50 mg ／ L Kan，50 mg ／ L Str）的 2 mL YEB 液体培养基中，28 ℃ 过夜培养，转接到 20 mL YEB 培养基中，28 ℃继续 培养至 OD600 为 0．6 左右，用刀片将烟草无菌苗叶片 边缘部分切去并弃中脉， 切成约 1 cm2 大小作为土 壤杆菌侵染外植体， 在土壤杆菌 菌液中侵染 5～10 min， 其 间 不 断 摇 动 ， 侵 染 后 的 外 植 体 用 无 菌 滤 纸 吸 干菌液置于 MS 分化培养基上（2．0 mg ／ L 6－BA＋0．1 mg ／ L NAA），28 ℃暗培养 2 d，转入 MS 筛选分化培 养 基 （50 mg ／ L Kan，200 mg ／ L Carb，2．0 mg ／ L 6 － BA＋0．1 mg ／ L NAA）中。 25 ℃光照培养约 2 周后，将 烟草愈伤组织及部分抗性芽转入新鲜培养基中继 代培养，待抗性芽长至 2 cm 左右切下转入 MS 生根 培 养 基 （50 mg ／ L Kan，200 mg ／ L Carb，0．5 mg ／ L IAA）中。 待根系发育良好进行室内移栽，随机选取 12 株 长 势 良 好 的 植 株 提 取 其 叶 片 总 DNA，PCR 和 琼脂糖凝胶电泳检测其是否含有 ze19 启动子，并设 立阴性对照 （野生型烟草基因组 DNA）、 阳性对照 （构建的重组质粒 pBIze19）。
中 图 分 类 号 ：Q785
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114（2011）13－2775-05
Cloning of 19 kD Zein Promoter from Maize and Construction of Plant Expression Vector
LI Hui－lun1，2，WEI Yan－li2，LI Hong－mei2，HU Jin－dong2，LI Ji－shun2，YANG He－tong2 （1．School of Life Science， Shandong University of Technology， Zibo 255049， Shandong， China；
xclihuilun＠126．com ；通 讯 作 者 ，杨 合 同 ，（ 电 子 信 箱 ）yanght＠keylab．net 。
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湖 北 农 业 科学
2011 年
析，以期构建种子特异性启动子，为玉米种子生物 反应器的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料和试剂 玉米自交系 9801、烟草（Nicotiana tabacum，WT）
摘 要 ：从 玉 米 自 交 系 9801 基 因 组 DNA 中 克 隆 了 玉 米 19 kD 醇 溶 蛋 白 基 因 （ze19）启 动 子 ，将 其 连 接 到
pMD18－T 载体上。 测序结果表明该序列与已报道序列同源性为 94％，包含 TATAbox、CAATbox 启动子基
本元件以及 GCN4、skn－1、prolamin box、－300 element 等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与克 隆 载 体 pMD18－T 在 T4 DNA 连 接 酶 作 用 下 16 ℃ 保温过夜，构建重组质粒 pMD18－ze19。 将连接反应 产物转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞， 提取质粒， 经 PCR、酶 切 鉴 定 后 ，将 阳 性 转 化 子 送 上 海 生 工 生 物工程技术服务有限公司测序，并保存菌种。 1．3 ze19－gus 融合表达载体的构建
第 50 卷第 13 期 201第1 年13 7期月
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.13 Jul．，2011
玉米 19 kD 醇溶蛋白启动子克隆与植物表达 载体构建
李慧伦 1，2，魏艳丽 2，李红梅 2，扈进冬 2，李纪顺 2，杨合同 2 （1．山东理工大学生命科学学院，山东 淄博 255049；2．山东省科学院生物研究所 ／ 山东省应用微生物重点实验室，济南 250014）