7、关于生化中的终点法中的两点法

关于生化中的终点法中的两点法，还有种叫法是固定时间法的一些题新手上路，有哪位大侠能先容先容终点法中的两点法的原理，在生化上怎么往做两点法呀（简单回答）最基本的生化反应方法有三种，其他的都是在此基础演变而来。

1。

速率法，有叫动态法，仪器连续检测生化反应过程中的吸光度变化，目的是得到吸光度变化速率。

酶活性的检测大多用此方法。

检测底物的是下降反应，又叫负反应，例如：ALT AST 等；检测天生物的是上升反应，又叫正反应，ALP。

2。

终点法。

仪器检测生化反应某一时间点的吸光度值，目的得到反应溶液的具体吸光度值。

常见的有GLU，TP ，ALB 等3。

两点法。

仪器检测生化反应两个时间点的吸光度值，第二点减往第一点，得到吸光度的差值，检测底物的差值为负，检测天生物的差值为正，例如，中生试剂的肌酐项目Cr。

生化仪无论半自动或全自动，都有实验参数设置，只要按试剂说明正确设置，再照试剂说明做实验就行了。

使用分光光度计另当别论。

两点法：又称为一级动力学法、固定时间法等，指在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比，即v=k[S]。

由于底物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。

这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必须经过一段延迟时间才能进进稳定反应期。

两点法不是什么终点法中的两点法,正确地说它应该属于动态法范畴,一种带标准的动态法.新手上路，有哪位大侠能先容先容终点法中的两点法的原理，在生化上怎么往做两点法呀（简单回答）最基本的生化反应方法有三种，其他的都是在此基础演变而来。

1。

速率法，有叫动态法，仪器连续检测生化反应过程中的吸光度变化，目的是得到吸光度变化速率。

酶活性的检测大多用此方法。

检测底物的是下降反应，又叫负反应，例如：ALT AST 等；检测天生物的是上升反应，又叫正反应，ALP。

2。

终点法。

仪器检测生化反应某一时间点的吸光度值，目的得到反应溶液的具体吸光度值。

常见的有GLU，TP ，ALB 等3。

两点法。

仪器检测生化反应两个时间点的吸光度值，第二点减往第一点，得到吸光度的差值，检测底物的差值为负，检测天生物的差值为正，例如，中生试剂的肌酐项目Cr。

生化仪无论半自动或全自动，都有实验参数设置，只要按试剂说明正确设置，再照试剂说明做实验就行了。

使用分光光度计另当别论。

两点法：又称为一级动力学法、固定时间法等，指在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比，即v=k[S]。

由于底物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。

这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必须经过一段延迟时间才能进进稳定反应期。

两点法不是什么终点法中的两点法,正确地说它应该属于动态法范畴,一种带标准的动态法.二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。

各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。

生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。

因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。

1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。

2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。

可设置常量、减量和增量。

8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。

9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。

10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。

总反应容量太少无法进行吸光度测定。

11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。

14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。

每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。

16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。

与试剂/样品比值有关。

17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）。

（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。

若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。

将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4．试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6．方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7．参考值范围对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。

一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。

在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。

2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。

此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。

因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。

如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。

因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。

若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式（一）概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式。

当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。

在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。

当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。

（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。

从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。

当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。

采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。

（三）次波长的确定方法当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。

如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。

一般来说，次波长应大于主波长100nm。

以主波长与次波长吸光度差来计算结果。

（四）双波长的具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。

目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和600nm。