高效液相色谱_线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中_2_受体激动剂及_阻断剂类药物残留
高效液相色谱法测定鸡肉中的二氯二甲吡啶酚
高效液相色谱法测定鸡肉中的二氯二甲吡啶酚程盛华;查玉兵;丁丽;杨春亮【摘要】目的:建立反相高效液相色谱法测定鸡肉中二氯二甲吡啶酚含量的方法.方法:采用Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6,5μm);流动相为甲醇-水(20:80),流速1.0mL/min,检测波长266nm,柱温35℃.结果:在0.05～5.00 mg/L的范围内呈良好的线性关系(r=0.999 7),RSD＜5.0%(n=5),检出限为5ug/kg,回收率92.3%～102.1%.结论:此方法快速、简单、准确,实际样品分析结果令人满意,适合于鸡肉中二氯二甲吡啶酚的检测.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2008(000)001【总页数】3页(P39-41)【关键词】高效液相色谱法;二氯二甲吡啶酚;鸡肉【作者】程盛华;查玉兵;丁丽;杨春亮【作者单位】中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001;中国热带农业科学院农产品加工研究所,湛江,524001【正文语种】中文【中图分类】TS21 前言二氯二甲吡啶酚俗称克球酚(clopidol)，是一种杀虫效果较高的抗球虫兽药，在畜禽饲养业中应用广泛。
但由于停药期控制不严,常导致药物在禽肉组织中有残留。
目前禽肉中克球酚残留量的测定方法主要有气相色谱法、液相色谱法、酶联免疫法等。
气相色谱法测定克球酚,样品需衍生化后再测定，操作步骤复杂、繁琐，此外因样品中杂质较多，容易产生干扰，造成结果的假阳性，而且定量不准。
酶联免疫法目前尚不成熟，且不能准确定量[1]。
我国曾颁布进出口商品检验行业标准，但该方法操作繁琐，回收率不高，重复性也不好。
本文建立了鸡肉中克球酚残留量的液相色谱法测定法，此方法快速、简单、准确，适合批量检测。
2 实验部分2.1 仪器与试剂Waters2695液相色谱仪，配2996二极管阵列检测器；Empower化学工作站；CXJ-IIB型低速大容量多管离心机；RE-52AA旋转蒸发器；SHB-III型循环水真空泵；MS1旋涡混合器；E120H超声波清洗器；万分之一电子天平。
畜禽肉中多类兽药残留的快速检测
畜禽肉中多类兽药残留的快速检测黄 立（昆明市食品药品检验所，云南昆明 650032）摘 要：建立了猪肉、牛肉、鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类共15种兽药残留量的快速检测方法。
样品经过Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液-2.5%乙酸乙腈溶液提取，经氯化钠、无水硫酸钠除水盐析后取乙腈相用高含碳量的C18吸附粉吸附净化，再用0.1%甲酸水乙腈（75+25）定容后上机检测。
结果显示，本方法测定三类混合药物的回收率在63.9%～104.0%，RSD在1.1%～12.2%，检测快速、灵敏度高、重复性好，定性定量准确可靠，适用于猪肉、牛肉及鸡肉中磺胺类、四环素类、喹诺酮类药物残留的快速检测。
关键词：液相色谱-串联质谱法；磺胺；四环素；喹诺酮Rapid Detection of Multiple Types of Veterinary Drug Residues in Livestock and Poultry MeatHUANG Li(Kunming Institute for Food and Drug Control, Kunming 650032, China) Abstract: A rapid method was established for the determination of 15 veterinary drug residues of sulfonamides, tetracyclines and quinolones in pork, beef and chicken. The samples were extracted by Na2EDTA-Mcllvaine buffer-2.5% acetic acid acetonitrile solution, and the acetonitrile phase was purified by adsorption with high carbon content C18 adsorbent powder after dehydration salting by sodium chloride and anhydrous sodium sulfate, and then fixed with 0.1% formic acid aqueous acetonitrile (75+25) and detected on the machine. The results showed that the method determines the recovery of the three types of mixed were 63.9%～104.0%, RSD were 1.1%～12.2%, rapid detection, high sensitivity, good repeatability, accurate and reliable qualitative and quantitative, suitable for the rapid detection of sulfonamides, tetracyclines, quinolones drug residues in pork, beef and chicken.Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamide; tetracycline; quinolone合理使用兽药可以提高畜禽养殖效率，节省成本，缩短出栏周期，进而增加收益，但越来越多的人为追求经济效益滥用药物，导致了一些兽药以残留的形式流入人体，从而对身体健康造成威胁[1]。
液相色谱—串联质谱法测定动物源性食品中4种β2-受体激动剂类药物残留
物源性食品中 ４种 ８一受体激动剂残留的快速检测 。 关键词 ：Ｂ一受体激动剂 ；动物源性食品 ；检测 ；Ｈ Ｌ — ： Ｐ Ｃ Ｍｓ 中 图分 类 号 ：Ｔ ２ ７３ Ｓ０Ｉ 文 献标 志码 ：Ａ ｄ ｉ ０ ９９ ｉ ｎ１７ — ６６ Ｘ） ０ ２０ ．３ ｏ：１． ６ ￣ｓ ．６ １９ ４ （ ． １ ． ０ ４ ３ ｓ ２ ５
ｔ ｅ ｄ ｔｒ ｉ ａｉｎ ｆ ｃ ｅ ｂ ｔｒ ｌ ｒｃｏ ａ ｎ ， ｓ ｌｕ ａ ｌ ａ ｄ ｔ ｒ ｕａｉ ｎ ａ ｉ ｌ ｄ ｒｖ ｄ ｆ ｏ ｓ ｈ ａ ｌｓ ａ ｅ ａ ｉ ｈ ｅｅ ｎ ｔ ｏ ｌｎ ｕ ｅ ｏ ， ａ ｔｐ ｍｉ ｅ ｍ ｏ ａ ｔｍｏ ｎ ｕ ｂ ｔｌ ｉ ｎ ｍａ ｅ ｅ ｏ ｄ ．Ｔ ｅ ｓ ｍｐｅ ｒ ｃｄ ｂ ｎ ｉ
作者简介 ：鲁立 良 （ ８ 一 １ １ ９
） ，男 ，安徽人 ，实验 师，研究方 向：食品和农产品安全 与质量检查 。Ｅ ｍ ｉ ｕｅｏ ｄ １ ６ ｏ — ａ ：ｂ ｙｎ ＠ ２ ． ｎ。 ｌ ｌ ｃ
’ 为通讯作者 。罗力力 ，女 ，高级实验师 ， 研究方 向：农兽药残留检测。
２１年 期 ０ 第５ ２
液相色谱一 串联质谱法测定 动物源性食 品 中 ４种 Ｉ 受体激 动剂类药物残 留 ３
鲁立 良 ， 罗力力 一 ， ，王 远 ，郝 家勇
（． １ 新疆农垦科学院 农业部食品质量监督检验测试 中心 （ 石河子） ，新疆 石河子 ８ ２ ０ ； ３０ ０
２ 石 河子 大学 食 品学 院 ，新 疆 石 河 子 ８ ２０ ） ． ３ ０ ０
ｈ ｄｒ ｌｚ ｄ ｎｄ ｘｔａ ｔ ｄ ｙ ｏｙ ｅ ａ ｅ ｒ ｃｅ ｗｉｈ ％ ｔ ｃ ｌｒ ｅ ｔ ａ ｉ ｉ ｗａｅ ． ａ ｔ ｎ ｌａ ｅ ｕｐ ｙ ｔ ５ ｉ ｒ ｈｏ ａ ｅｉ ｃｄ ｎ ｃ ｔｒ ｎｄ ｈｅ ｃｅ ｎ ｄ ｂ Ｗ ａｅ ｓ ｔ ｒ Ｏａ ｉ Ｍ ＣＸ ｓ ｌｄ ｓｓ ｏｉ ｐｈ ｓ ａｅ
高效液相色谱 串联质谱法检测鸡肉中金霉素 差向金霉素
高效液相色谱串联质谱法检测鸡肉中金霉素差向金霉素摘要：建立了高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）快速测定鸡肉中差向金霉素、金霉素的检测方法。
均质样品用PH=4.0 EDTA-McIIvaine缓冲溶液提取，经Oasis HLB SPE小柱净化，采用LC-ESI-MS/MS和正离子多反应监测（MRM）模式检测。
差向金霉素在0.025~0.8 μg/mL，金霉素在0.005~0.2 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.99。
在0.05、0.10、0.15 mg/kg的加标水平下，回收率为73.0%~101.6%，相对标准偏差（RSD）为2.1%~12.2%。
差向金霉素和金霉素的定量限分别为30.0 μg/kg、10.0 μg/kg。
该方法样品处理简单，可同时检测差向金霉素和金霉素的残留，且准确度和精密度均符合残留分析的要求。
关键词固相萃取；高效液相色谱串联质谱；差向金霉素；金霉素；鸡肉金霉素（Chlortetracycline，CTC）因其抗菌谱广和价格便宜等特点被广泛的应用于兽医临床和畜牧业养殖中。
金霉素在动物经饲料摄取后，能残留于动物肌肉组织、肝脏和肾脏甚至骨骼中[1]。
另外，金霉素在生产和储存以及动物生产代谢的过程中，也会产生多种发酵和代谢产物，代谢产物与母体在活性，毒性以及环境的耐受性上存在差异[2]。
在弱酸性条件下，金霉素易转化为其代谢产物差向金霉素（4-Epi-chlortetracycline，ECTC），差向金霉素为金霉素的差向异构体，无抗菌活性，但毒副作用增加，已经被欧盟确定为残留标识物[3]。
有研究表明[4]：给蛋鸡饲喂含有金霉素的饲料后，鸡蛋中有金霉素的代谢物差向金霉素检出。
而目前，我国对动物食品中金霉素残留的监控，仅停留在原形药物金霉素上，尚未把差向金霉素作为残留标识物来监控。
而国外已开始金霉素及其代谢物的检测方法[5-11]的研究，我国采用的高效液相色谱测定金霉素的检测方法大部分都没有将金霉素和差向金霉素区别开来，关于鸡肉中金霉素及差向金霉素同步快速检测方法，国内外报道甚少。
超高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的11种甾体激素类药物
超高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的11种甾体激素类药物贺利民;黄显会;方炳虎;黄士新;曹莹;陈建新;曾振灵;陈杖榴【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2008(26)6【摘要】建立了采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定猪、牛、羊和鸡肌肉组织及鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、司坦唑醇、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等11种甾体激素多残留的分析方法.试样在碱性条件下用叔丁基甲醚提取,冷冻离心脱脂净化,以乙腈和甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,反相液相色谱分离.采用电喷雾离子化、多反应监测方式(MRM),对11种甾体激素同时进行定性定量测定.动物肌肉和鲜蛋中睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的检出限为0.3 μg/kg,群勃龙、诺龙、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的检出限为0.4 μg/kg.在动物组织及鸡蛋中添加1,2及10 μg/kg 水平的药物回收试验中,睾酮、甲基睾酮、勃地龙、美雄酮及司坦唑醇的回收率均在62.3%～105%之间,相对标准偏差为0.5%～15%;群勃龙、诺龙、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙的回收率大于50.0%,相对标准偏差小于16%.11种甾体激素在1～100 μg/L范围内,线性关系良好,相关系数都大于0.99.该方法的样品前处理简单、快速,测定灵敏、准确,选择性好,可满足动物源食品中甾体激素类药物多残留的同时测定.【总页数】6页(P714-719)【作者】贺利民;黄显会;方炳虎;黄士新;曹莹;陈建新;曾振灵;陈杖榴【作者单位】华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;上海市兽药饲料检测所,上海,201103;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院药理研究室,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织中氨基甲酸酯类杀虫剂及其代谢物残留 [J], 邓龙;郭新东;何强;杨群华;沈玉栋;王弘2.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量 [J], 张凤清;王岩松;范世华;周长民3.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物肌肉组织中6种氨基糖苷类药物残留[J], 钟名琴;黄婷;吴雯娟;罗燕;丁燕玲4.QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中61种激素类药物残留 [J], 任雪冬; 王璐; 熊爽5.分散微固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水样中3种氯霉素类和11种激素类药物残留 [J], 粟有志;李艳美;周均;尚爽;李芳;王兴磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
液相色谱-_串联质谱法测定鸡肉中甲氧苄啶残留量的不确定度评定
液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中甲氧苄啶残留量的不确定度评定徐美玲（南京市产品质量监督检验院（南京市质量发展与先进技术应用研究院），江苏南京 210041）摘 要：目的：高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中的甲氧苄啶残留量，评估实验过程中引入的不确定度。
方法：建立数学模型，对不同分量从来源进行不确定度分析，分别量化后合成，最终形成鸡肉中甲氧苄啶残留量测定的不确定度分析方法。
结果：鸡肉样品甲氧苄啶残留量为10.011 3 μg·kg-1，包含因子k=2时，其扩展不确定度为0.778 8 μg·kg-1。
结论：在鸡肉中甲氧苄啶的检测中，可以通过提高标准曲线的准确度以及仪器的精密度降低结果的不确定度，从而提高结果的准确性。
关键词：鸡肉；甲氧苄啶；液相色谱-串联质谱；不确定度Uncertainty Evaluation for Determination of Trimethoprim Residues in Chicken by Liquid Chromatography-TandemMass SpectrometryXU Meiling(Nanjing Institute of Product Quality Inspection (Nanjing Institute of Quality Development and Advanced TechnologyApplication), Nanjing 210041, China)Abstract: Objective: To determine trimethoprim residue in chicken meat by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and to evaluate the uncertainty introduced in the experiment. Method: A mathematical model was established to analyze the uncertainty of different components from the source, which were quantified and synthesized respectively, and finally an uncertainty analysis method for the determination of trimethoprim residue in chicken was formed. Result: The residue trimethoprene in chicken samples was 10.011 3 μg·kg-1, and the estended uncertainty was 0.778 8 μg·kg-1 when k=2 was included. Conclusion: In the detection of trimethoprim in chicken, the accuracy of the results can be improved by improving the accuracy of the standard curve and the precision of the instrument to reduce the uncertainty of the results.Keywords: chicken; metrimethoprim; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; uncertainty甲氧苄啶可以作为磺胺类药物的抗菌增效剂，可以干扰细菌的叶酸代谢进而抑制细菌的生长。
超高效液相色谱-串联质谱方法同时测定猪肉中7种β-受体激动剂残留量
１ ．． ． ３１ ３
液 相色 谱 条 件
色谱 柱 ：Ｚ ｒａ Ｂ ｓ ．ｍｍ × ｌ Ｏ ｏｂ ｘ Ｓ ＣＩ２１ （ Ｏ ｍｍ，１８ ．“ｍ） ：
柱 温 ：３ ０℃ ；进 样 量 ： １ Ｌ； 流 动 相 ：Ａ 相 为 ０． ％ ０ １
甲酸 水 溶 液 ：Ｂ相 为 乙腈 ； 二元 梯 度 洗 脱 ：０ ｎ，Ａ、 ｍｉ
ｒ ｓｄ ｅ ｉｕｅ
中 图分 类 号：０６ ７６ ５ ．３
文 献 标 识码 ：Ａ
文 章编 号：１０ —１３２ １ ）５０ ２ —５ ０ １８ ２ （０ ２０ ０ ５０
ｐ 受体 激 动 剂（ｐ ａ ｏ ｉｔ） 一 —ｇ ｎｓｓ ， 主 要 包 含 克伦 特 罗 、 沙 丁 胺 醇 、 莱 克 多
西 马特 罗 、氯 丙 那 林 ７种 较 为 常 见 的 Ｂ 受 体激 动 剂 残
件下 用氮 气吹至 ０５ ． ｍＬ，加 甲醇 一．％ 甲酸（ 积 比 １９溶 ０１ 体 ：） 液２ ｍＬ，涡 旋 混匀 ，过 ０． ｍ 滤 膜 后 进样 检 测 。 ２ｂ ｔ
１－ ．３ ３ ＵＰ Ｃ— ／ Ｌ ＭＳＭＳ条件
肉类研究
中国 肉类 亩品综 合 研究 中心
ＣＨＩ ＮＡ Ｍ Ｅ ＡＴ Ｒ ＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＥ ＥＳ Ｒ
乙醇 胺 Ａ 属 于 瘦 肉精 新 品种 ， 在 动 物 源 食 品 中报 道 很
少 。孙 文 等 研 究 了猪肌 肉组 织 中 苯 乙醇 胺 Ａ残 留液 相 色 谱 一串联 质 谱 检 测 方 法 ， 其 中前 处 理 用 的 酶 解 方 法 ， 过 程 繁 琐 。 而 目前 关 于 猪 肉 中 苯 乙醇 胺 Ａ 、 克伦 特 罗 等 Ｂ一受 体 激 动 剂 同 时快 速 检 测 的 方 法 还 末 见 报 道 。 因此 ，本 研 究 旨 建 立 猪 肌 肉组 织 中苯 乙醇 胺 Ａ、 盐 酸 克 伦 特 罗 、沙 丁 胺 醇 、 莱 克 多 巴 胺 、特 布 他 林 、
高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鸡肉中残留的磺胺类和氟喹诺酮类兽药
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! ! 磺胺 类 药 物 （ "#$%&’()*+," ，-." ） 和氟喹诺酮 类药物 （ %$#&/&0#*’&$&’," ，12" ） 被广泛地应用于预 防和治疗 家 禽 的 细 菌 感 染 性 疾 病
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<4!>:- 色谱 柱 （ $&+ )) . %, ’ )) ，& ! ) ） ， 英国 9*H/&)("" 2!I>1 质谱检测器 （ 配 7-8 源） ，9(""! $J’,K %, + 数据处理软件。 ! ! L2!" 型 匀 浆 机 （ 江苏省江阴县祝塘仪器厂） ； 5M#+ !$, % . 型 离 心 机 （北京雷勃尔离心机有限公 司） ；-N!# 型 快 速 混 匀 器 （常州国华电器有限公 （ 上海第二分析仪器厂） 。 司） ； 43-!$ 6 型 O3 计 7=<8!#) 固相萃取柱 （ &++ )C ， " )5 ， 上海安谱科学 仪器有限公司） 。孔径为 +, $$ ! ) 的滤膜。 ! ! $" 样品处理 ! ! $ ! !" 准备 ! ! 以当地食品市 场 购 买 的 新 鲜 鸡 肉 作 为 样 品， 切 碎后于 * $+ E 冷冻储存。 ! ! $ ! #" 提取 ! ! 准确称取已切碎的鸡肉 &, + C 置于 &+ )5 塑料 离心管 中， 加 入 一 定 量 的 混 合 标 准 储 备 液、 ) )5 提 取液 （$P 醋 酸!乙 腈 ） ， 在 暗 处 静 置 #+ )*’ ， 匀浆提 取 $ )*’ ， - +++ / D )*’ 离 心 #+ )*’ ， 取 出 上 清 液。 分别用 ) )5 、 % )5 提取液重复提取残 渣两次， 合并 " 次提取液于 &+ )5 塑 料 离 心 管 中， - +++ / D )*’ 离 心 #+ )*’ 。移取 #+ )5 上清液于玻璃 离心 管中， 于 （ %& / # ） E 水 浴 中 用 氮 气 吹 至 近 " )5 ， 涡 旋 混 匀。 用正己烷萃取脱脂 $ 0 " 次， 弃 去 上 层 液 体， 将下层 液体于 （ %& / # ）E 水浴中用氮气吹至约 +, ) )5 。 ! ! $ ! $" 净化 ! ! 预先用 & )5 甲醇、 & )5 水 活 化 7=<8!#) 固 相 萃取柱。上 样 后， 减 压 抽 干， 加 入 & )5 水 淋 洗， 用 ’ )5 % P 氨水 ! 甲醇进行洗脱， 洗脱液于 （ %& / # ）E 水浴中用氮气 吹 至 近 干， 再 用 流 动 相 定 容 至 # )5 ， 过 +, $$ ! ) 滤膜后进样分析。 ! ! %" 液相色谱 "质谱联用分析 ! ! % ! !" 色谱条件 ! ! 流 动 相： 乙 腈 和 +, +& P 甲 酸 溶 液； 梯度洗脱程 序见表 # ； 流 速： #, + )5 D )*’ ； 进 样 量： $+ ! 5 ， 分流 比： #1 " ； 柱温： %+ E ； 检测波长： $)# ’) 。
在线净化液相色谱_串联质谱法测定畜禽粪便中7种_2_受体激动剂
22-第42 卷2014 年12 月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Jo urnal of Analytical Chemistry第12 期1797 ～1803DO I:10〃11895 / j〃iss n〃0253-3820〃140719在线净化液相色谱-串联质谱法测定畜禽粪便中7 种β2-受体激动剂李丹妮* 严凤吴剑平周悦榕顾欣张鑫( 上海市动物疫病预防控制中心，上海201103)摘要建立了同时测定畜禽粪便中福莫特罗、沙美特罗、卡布特罗、克伦异磅特罗、克伦潘特、克伦塞罗和羟甲基克伦特罗7 种β2 -受体激动剂的超高效液相色谱-串联质谱(U PL C-M S /M S)分析方法。
样品经酸性乙腈充分提取后，再用0．2%甲酸溶液稀释，提取液用阳离子交换在线净化柱(H y p e r S e p Ｒe t a i n C X)净化，2%氨水-甲醇溶液将分析物洗脱转入至H y p e rs il G o l d C18 分析柱，经色谱分离后，用串联质谱检测。
在正离子电喷雾条件下，采用选择反应监测模式检测，以外标法定量。
结果表明，7 种β受体激动剂在0．5 ～100 μg/L 的浓度范围内线性良好，线性相关系数均大于0．9928。
取3 倍信噪比下，畜禽粪便中7 种β2 受体激动剂的检出限为 1μg/k g，定量限为5 μg/k g。
在空白猪、鸡粪便中添加5 ～50 μg/k g水平的7 种β2 受体激动剂，得到平均回收率为67%～112%，其相对标准偏差为2．9%～10．2%。
本方法简单快速，适用于畜禽粪便中β2 -受体激动剂残留的定量及确证分析。
关键词在线净化液相色谱-串联质谱; 7 种β2 -受体激动剂; 残留; 畜禽粪便1 引言β2 -肾上腺素能激动剂，简称β2 -受体激动剂，俗称“瘦肉精”，在动物体内( 猪、鸡) 可通过增加蛋白质合成，促进脂肪组织的分解代谢，显著提高酮体瘦肉率［1 ～3］。
超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留
超高效液相色谱泊联质谱测定动物肌肉组织中32种β激动剂、β阻滞剂和糖肽类抗生素药物残留摘要建立了同时测定动物肌肉组织中27种β激动剂、3种β阻滞剂和2种糖肽类抗生素的超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）方法。
样品经酶解、蛋白沉淀后，以乙酸乙酯异丙醇（6∶4，V/V）提取，StarataXC固相萃取净化，BEH C18色谱柱分离，乙腈0.1%甲酸梯度洗脱，串联质谱ESI+电离，多反应监测模式检测，外标法定量。
结果表明，32种目标物在线性范围内相关性良好（R2>0.995），多巴胺、瑞普特罗、万古霉素和去甲万古霉素的方法检出限为5 μg/kg，其它目标物的检出限为3 μg/kg；平均加标回收率为83.6%～103%，相对标准偏差（n=6）为3.9%～10.4%，日间精密度为4.5%～9.8%。
结果表明，本方法准确、灵敏，适用于动物肌肉组织中β激动剂、β阻滞剂，以及糖肽类抗生素的高通量测定。
关键词β激动剂；β阻滞剂；糖肽类抗生素；动物肌肉；超高效液相色谱串联质谱法1引言β激动剂俗称“瘦肉精”，主要作为促生长剂被添加到动物饲料中，长期食用含此类药物残留的畜禽产品可能会引起肌肉振颤、心悸、紧张等症状[1，2]，多个国家和地区已禁止将β激动剂用于畜禽生产[3～5]。
β阻滞剂是一类能拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体激动作用的药物，常在动物运输或屠宰前数小时内使用，以降低动物因应激而造成的突然死亡率及对动物肉质的影响，残留风险较大，欧盟和国际食品安全法典委员会已对动物组织中β阻滞剂卡拉洛尔的残留做了限量规定[6，7]（猪肌肉为5 μg/kg，猪肝、肾为25 μg/kg）。
万古霉素和去甲万古霉素属于糖肽类抗生素，用于治疗细菌感染，我国农业部第560号公告规定万古霉素为禁用兽药[8]。
虽然目前已有动物尿液、血液和肌肉组织中β激动剂[9～13]、β阻滞剂[14]和糖肽类抗生素[15]残留的检测方法研究，但检测对象多为单一的一类药物，没有同时检测这3类药物的研究。
高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料、养殖用水中五氯酚的残留
中国畜牧兽医 2024,51(4):1438-1447C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留朱季升1,2,邢维海2,李 政3,王 力3,张亚伟1,张元庆1,杨 丹4,杨悠悠2(1.山西农业大学动物科学学院,晋中030801;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京100193;3.中粮家佳康食品有限公司,北京100020;4.国贸食品科学研究院有限公司,北京102209)摘 要:ʌ目的ɔ本试验旨在建立一种测定猪饲料㊁饲料添加剂㊁水等养殖环节投入品中五氯酚残留的高效液相色谱-三重四极杆质谱方法㊂ʌ方法ɔ待测样品经碱性甲醇水溶液提取,使用阴离子固相萃取柱富集净化,经氮吹浓缩后用2%甲酸甲醇复溶,以5m m o l /L 乙酸铵溶液-甲醇为流动相,经P o r o s h e l l 120E C -C 18(3m mˑ100m m ,2.7μm )色谱柱分离;负离子模式下,采用多反应监测模式(m u l t i p l e r e a c t i o nm o n i t o r i n g ,M R M )进行检测;使用基质匹配外标法测定五氯酚的含量,并对所建方法的线性关系㊁检测限(l i m i to fd e t e c t i o n ,L O D )㊁定量限(l i m i to fqu a n t i t a t i o n ,L O Q )㊁回收率㊁准确度㊁精密度㊁基质效应等指标进行考察㊂ʌ结果ɔ猪饲料和饲料添加剂中五氯酚的检测限和定量限分别为0.1和0.5μg /k g ,养殖用水中五氯酚的检测限和定量限分别为5和12.5n g /L ;饲料和饲料添加剂中五氯酚定量范围为0.5~20μg /k g ,养殖用水中五氯酚定量范围为12.5~500n g /L ,方法线性关系良好,相关系数(R 2)均>0.999㊂该方法在饲料和饲料添加剂以及养殖用水中的平均加标回收率为69.8%~119.5%,相对标准偏差(r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ,R S D )为1.62%~9.86%,基质效应(m a t r i xe f f e c t ,M E )为0.62~1.29㊂ʌ结论ɔ本试验所建方法简便㊁快捷㊁灵敏度高㊁重复性好,适用于猪配合饲料等养殖投入品中五氯酚的测定,可为养殖环节投入品中五氯酚污染筛查提供准确高效的技术手段,从源头保障动物源性产品安全㊂关键词:五氯酚;饲料;固相萃取;高效液相色谱-三重四极杆质谱中图分类号:S 816文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.012 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-30基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y 2023P T 14);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2022-YW F -Z Y S Q -09);北京市科技计划课题(Z 221100007122006)联系方式:朱季升,E -m a i l :z h u j i s h e n g 2022@163.c o m ㊂通信作者张元庆,E -m a i l :y u a n q i n g _z h a n g @163.c o m ;杨丹,E -m a i l :y a n g_d a n @c o f c o .c o m ;杨悠悠,E -m a i l :y a n g y o u 229@126.c o m D e t e r m i n a t i o no f P e n t a c h l o r o ph e n o lR e s i d u e s i nS w i n eF o r m u l aF e e d a n dF a r m W a t e r U s i n g H i g hP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y -t r i p l e Q u a d r u p o l eM a s s S p e c t r o m e t r yZ HUJ i s h e n g 1,2,X I N G W e i h a i 2,L I Z h e n g 3,WA N GL i 3,Z H A N G Y a w e i 1,Z HA N G Y u a n q i n g 1,Y A N G D a n 4,Y A N G Y o u yo u 2(1.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,J i n z h o n g 030801,C h i n a ;2.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lN u t r i t i o n ,I n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e o f C A A S ,B e i j i n g100193,C h i n a ;3.C O F C OJ i a k a n g F o o dC o .,L t d .,B e i j i n g 100020,C h i n a ;4.C h i n a I n t e r n a t i o n a l T r a d eF o o dS c i e n c eR e s e a r c h I n s t i t u t eC o .,L t d .,B e i j i n g 102209,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔA h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y -t r i p l e q u a d r u po l e m a s s s p e c t r o m e t r y (H P L C -M S /M S )m e t h o dw a s d e v e l o p e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p e n t a c h l o r o p h e n o l (P C P )i ns w i n ef e e d ,f e e da d d i t i v e sa n d w a t e r .ʌM e t h o d ɔT h es a m pl e s w e r ee x t r a c t e d w i t h a q u e o u sa l k a l i n e m e t h a n o l i cs o l u t i o n ,e n r i c h e d a n d c l e a n e d u p u s i n g an a n i o n i cs o l i d p h a s e4期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留e x t r a c t i o n c o l u m n,r e c o n s t i t u t e dw i t h2%f o r m a t em e t h a n o l a f t e r n i t r og e n d r y i n g.W i t h5m m o l/La m m o n i u ma c e t a t e s o l u t i o n-m e t h a n o l a sm ob i l e p h a s e,P o r o s h e l l120E C-C18(3m mˑ100m m,2.7μm)c o l u m n w a su s e dt os e p a r a t e P C P.U n d e rt h en e g a t i v ei o n i z a t i o n,m u l t i p l er e a c t i o n m o n i t o r i n g m o d e(M R M)w a su s e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fP C P.M a t r i x-m a t c h e de x t e r n a l q u a n t i f i c a t i o n m e t h o d w a su t i l i z e dt o q u a n t i t a t e P C P.L i n e a rr e l a t i o n s h i p,l i m i t so fd e t e c t i o n (L O D),l i m i t so f q u a n t i f i c a t i o n(L O Q),r e c o v e r y,a c c u r a c y,p r e c i s i o n,m a t r i xe f f e c ta n do t h e ri n d i c a t o r s o f t h e e s t a b l i s h e dm e t h o dw e r e i n v e s t i g a t e d.ʌR e s u l tɔT h eL O Da n dL O Q w e r e0.1a n d0.5μg/k g i n l i v e s t o c kf e e d,f e e d i n g r e d i e n t sa n df e e da d d i t i v e s,w h i l e5a n d12.5n g/Li nf a r m w a t e r,r e s p e c t i v e l y.T h e l i n e a r r a n g eo fP C P i n l i v e s t o c k f e e d,f e e d i n g r e d i e n t s a n d f e e da d d i t i v e s w a s f r o m0.5t o20μg/k g,a n d t h e l i n e a r r a n g eo f f a r m w a t e rw a s f r o m12.5t o500n g/L.T h e l i n e a r c o e f f i c i e n t(R2)w a sm o r e t h a n0.999,s h o w i n g t h e g o o d l i n e a r i t y.I n a d d i t i o n,t h e r e c o v e r i e s r a n g e d f r o m69.8%t o119.5%a n d t h e r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n(R S D)w e r e f r o m1.62%t o9.86%. T h em a t r i xe f f e c t(M E)w a s0.62-1.29.ʌC o n c l u s i o nɔT h em e t h o de s t a b l i s h e d i n t h i s s t u d y w i t h h i g hs e n s i t i v i t y,h i g ha c c u r a c y a n d g o o d r o b u s t n e s sw a s s u i t a b l e f o r t h e s c r e e n i n g o f P C P i n s w i n e f o r m u l a f e e d a n do t h e r f a r m i n g i n p u t s t o e n s u r e t h e q u a l i t y a n d s a f e t y o fm e a t p r o d u c t s.K e y w o r d s:p e n t a c h l o r o p h e n o l;f e e d;s o l i d p h a s e e x t r a c t i o n;H P L C-M S/M S五氯酚(p e n t a c h l o r o p h e n o l,P C P)是一种有机氯农药,在杀虫㊁除草㊁杀菌㊁木材防腐等方面效果良好[1],其化学性质稳定,难以降解,可溶于甲醇㊁乙腈等有机溶剂,微溶于水;五氯酚分子结构中含有酚羟基,极性较强,在碱性条件下可转化为五氯酚酸盐,自然环境中多以五氯酚酸钠的形式存在,具有良好的水溶性(图1)㊂在20世纪,五氯酚及其钠盐曾被广泛用于养殖水体消毒和血吸虫病防治[2],在发挥其功效的同时对环境造成了严重污染[3]㊂五氯酚在生物体内蓄积可引起氧化磷酸化途径解偶联,造成能量代谢障碍[4],长期暴露有致畸㊁致癌㊁致突变等毒副作用,严重时会导致生物体的死亡㊂当前在水生动物[5-6]㊁畜禽动物[7]㊁人体血液[8]㊁尿液[9-10]等组织中皆有检出案例,说明五氯酚已经进入食物链[11],并且通过生物富集作用严重威胁到了人类的生命安全㊂因五氯酚具有生物毒性㊁难以降解㊁易生物富集等特点,国际上将其认定为持久性有机污染物(P O P s)[12],世界卫生组织也将其列为一类致癌物;2019年底,中国农业农村部发布第250号公告明确规定,五氯酚在动物性食品中不得检出㊂但近年来在畜禽产品中检出五氯酚的情况仍屡有报道,据市场监督管理总局统计结果,2020年1月 2021年11月期间,在猪肉中共检出43次㊁牛肉中18次㊁羊肉中12次[13],禽肉中2次[14]㊂究其原因主要来源于畜禽养殖生产过程中的饲料及水污染[15-16],目前有关饲料和水等养殖投入品中五氯酚的检测方法存在灵敏度低㊁操作繁复等问题[17-18],因此,亟需建立一种更加简便快捷㊁灵敏度高㊁准确性高的饲料等养殖投入品中五氯酚的检测方法,从源头保障动物源性产品安全㊂图1五氯酚及五氯酚酸钠化学结构图F i g.1C h e m i c a l s t r u c t u r eo f p e n t a c h l o r o p h e n o la n ds o d i u m p e n t a c h l o r o p h e n o l a t e由于饲料等养殖投入品中含有较多的蛋白质㊁脂肪㊁色素等物质,会严重影响分析结果的准确性,并极易污染检测设备,因此需寻求合适的样品前处理方法㊂目前,五氯酚测定的前处理方法主要有液液萃取法(L L E)[19]㊁加速溶剂萃取法(A S E)[20]㊁Q u E C h E R S[21]㊁固相萃取法(S P E)[22-23]㊁固相微萃取法(S P M E)[24-25]㊁分子印迹法(M I T)[26-27]等,其中S P E法是通过选择性吸附或选择性洗脱,实现目标化合物与基质中干扰物质的分离方法,可显著降低基质效应㊂固相萃取柱的选择需要综合考虑目标化合物的性质与基质的种类㊂分析检测的方法主要是色谱法和质谱法,常用的分析仪器有液相色谱仪(L C)[22]㊁气相色谱仪(G C)[28]㊁液相色谱-质谱联用仪(L C-M S)[29]㊁气相9341中国畜牧兽医51卷色谱-质谱联用仪(G C-M S)[30-31]㊂其中L C和G C 法仅通过保留时间定性,存在灵敏度低,易存在假阳性的情况,且由于五氯酚强极性㊁高沸点等特点,在使用G C和G C-M S时,需进行衍生化反应,操作复杂耗时,因此,液相色谱-串联质谱联用仪在五氯酚精准检测方面具有较明显优势㊂本研究为重点考察养殖环节是否存在五氯酚酸钠污染的风险,拟建立一种基于固相萃取法等样品前处理方法,结合高效液相色谱-三重四极杆质谱(H P L C-M S/M S)的猪配合饲料㊁添加剂等养殖投入品中五氯酚的分析方法,以期为生猪养殖过程中的五氯酚污染筛查提供参考和依据㊂1材料与方法1.1样品采集2023年3月-2023年5月,依照‘饲料采样“(G B/T14699.1-2005)和‘水质采样技术指导“(H J494-2009)从北京周边养殖场采集了具有代表性的33种各阶段猪配合饲料㊁22种饲料原料㊁49种饲料添加剂和22份水样,样品种类信息见表1㊂空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品均由国贸食品科学研究院有限公司提供,经方法验证后均为五氯酚阴性㊂表1样品信息T a b l e1S a m p l e i n f o r m a t i o n样品S a m p l e s种类T y p e s数量N u m b e r 猪配合饲料仔猪配合饲料9S w i n e f o r m u l a f e e d中猪配合饲料4大猪配合饲料5生长育肥猪配合饲料8妊娠母猪配合饲料2哺乳母猪配合饲料3后备母猪配合饲料2饲料原料鱼粉2F e e d i n g r e d i e n t玉米2碎米3小麦麸2亚麻籽1膨化大豆1菜籽粕2豆粕4续表样品S a m p l e s种类T y p e s数量N u m b e r小麦次粉3小麦1大麦壳1饲料添加剂氨基酸㊁氨基酸盐及其类似物17 F e e da d d i t i v e矿物元素及其络(螯)合物9维生素及类维生素8防腐剂㊁防霉剂和酸度调节剂5抗氧化剂2酶制剂5微生物3养殖用水饲用水15 F a r m w a t e r清洁用水4污水3 1.2主要试剂五氯酚标准品(纯度>98.9%),购自D r.E h r e n s t o r f e r公司;乙腈㊁甲醇(色谱纯)㊁乙酸铵(质谱纯)均购自T h e r m oF i s h e r公司;25%氨水㊁甲酸㊁三乙胺(色谱纯)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司;试验用水为经M i l l i-Q处理后的一级水(>18.2MΩ)㊂1.3主要仪器高效液相色谱-质谱联用仪(6470T r i p l eQ u a d L C/M S,安捷伦科技有限公司);数控超声波清洗器(K Q-500D E,昆山市超声仪器有限公司);小型高速冷冻离心机(5810R,艾本德股份公司);涡旋混合器(V O R T E X-5,其林贝尔仪器制造有限公司);分析天平(J A3003,上海力辰仪器科技有限公司);隔膜真空泵(GM-0.33A,天津津腾实验设备有限公司);小型粉碎机(S M-3L,台湾祥泰精机股份有限公司);超纯水制备仪(M i l l i-Q A d v a n t a g eA10,默克密理博公司);MA X固相萃取小柱(60m g/3m L,北京康普兴科技有限公司)㊂1.4色谱与质谱条件1.4.1色谱条件使用A g i l e n tP o r o s h e l l120E C-C18(3m mˑ100m m,2.7μm)色谱柱;柱温40ħ;进样量为5μL;流速:0.3m L/m i n;流动相A 相为5m m o l/L乙酸铵水溶液,B相为甲醇,梯度洗脱方法见表2㊂04414期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留表2梯度洗脱条件T a b l e2M o b i l e p h a s e g r a d i e n t e l u t i o nm e t h o d s时间T i m e/m i n流动相M o b i l e p h a s e/%A B 06040 16040 5595 85951.4.2 质谱条件采用喷射流电喷雾离子源(A J SE S I),负离子模式;毛细管电压-3500V;喷嘴电压-500V;雾化气温度300ħ,雾化气流速12L/m i n,雾化器压力40p s i;鞘气温度350ħ,鞘气流速10L/m i n;采用多反应监测模式(M R M)进行离子监测,其余质谱参数见表3㊂表3五氯酚M R M监测参数T a b l e3P e n t a c h l o r o p h e n o lM R M m o n i t o r i n gp a r a m e t e r s前体离子P r e c u r s o r i o n/(m/z)产物离子P r o d u c t i o n/(m/z)驻留时间D w e l l/m s碎裂电压F r a g m e n t o r/V碰撞池加速电压C e l l a c c e l e r a t o r v o l t a g e/V 262.7262.71001354 264.7*264.7*1001354 266.7266.71001354 268.7268.71001354*,定量离子对*,Q u a n t i t a t i v e i o n p a i r s1.5样品前处理1.5.1饲料及饲料原料样品前处理样品粉碎后称取2.00g置于离心管中,加入6m L含5%三乙胺的甲醇水(V/V为7ʒ3)溶液,涡旋混匀1m i n,超声提取5m i n,3000r/m i n离心5m i n,收集上清液,重复上述步骤1次,合并两次所得上清液㊂将上清液移入经5m L甲醇㊁5m L水活化后的MA X固相萃取小柱,自然流出,然后依次加入5m L5%氨水㊁5m L甲醇㊁5m L2%甲酸甲醇水(V/V为1ʒ1)淋洗,抽干萃取柱5m i n后使用4m L8%甲酸甲醇洗脱,收集洗脱液,氮吹浓缩至近干,加入2m L2%甲酸甲醇溶液涡旋混匀,过0.22μm有机相滤膜后,供检测分析㊂1.5.2水样前处理量取40m L水样于离心管中,加入10m L25%氨水,涡旋混匀1m i n,移入经5m L甲醇㊁5m L水活化后的MA X固相萃取小柱,自然流出,然后依次加入5m L甲醇㊁5m L2%甲酸甲醇水淋洗,后续步骤同饲料及饲料原料样品前处理㊂1.5.3饲料添加剂样品前处理称取2.00g样品,置于离心管中,加入6m L含5%三乙胺的甲醇水溶液,涡旋混匀1m i n,超声提取5m i n,3000r/m i n 离心5m i n,收集上清液,重复上述步骤1次,合并两次所得上清液,氮吹至近干,后续步骤同饲料及饲料原料样品前处理㊂1.6溶液制备1.6.1标准溶液制备准确称取1m g五氯酚标准品,使用100m L甲醇溶解配为10m g/L的五氯酚标准储备溶液,于-20ħ保存备用㊂1.6.2空白基质溶液制备取空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品,经1.5所述样品前处理方法处理后,制为空白基质溶液,于-20ħ保存备用㊂1.7方法学验证1.7.1线性关系标准溶液经甲醇梯度稀释后,配制成浓度为5㊁12.5㊁25㊁50㊁100㊁200㊁500㊁1000μg/L的标准工作液,准确移取1.6.2所制空白基质溶液(980μL)和20μL不同浓度的标准工作液,涡旋混匀,配制不同浓度的基质匹配标准溶液(表4),上机检测后,以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制基质匹配标准曲线㊂1441中国畜牧兽医51卷表4各基质匹配标准溶液中五氯酚折算后浓度T a b l e4T h e c o n v e r t e d c o n c e n t r a t i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n t h e s t a n d a r d s o l u t i o nm a t c h e db y e a c hm a t r i x基质M a t r i c e s浓度C o n c e n t r a t i o n饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s/(μg/k g)0.10.5151020饲料添加剂F e e da d d i t i v e s/(μg/k g)0.10.5151020养殖用水F a r m w a t e r/(n g/L)512.5501002005001.7.2检测限和定量限取所制各基质匹配标准溶液,经仪器检测后,以五氯酚定量离子色谱信号信噪比(S/N)ȡ3作为检测限(l i m i to fd e t e c t i o n, L O D),以S/Nȡ10作为定量限(l i m i t o f q u a n t i t a t i o n,L O Q)㊂1.7.3准确度与精密度以加标回收试验验证方法的准确度与精密度,空白猪配合饲料㊁饲料添加剂㊁养殖用水样品各称取6份,通过添加五氯酚标准储备溶液制为低㊁中㊁高3水平的加标样品,按照1.5样品前处理方法处理后检测分析,每个添加水平重复测定6次,计算回收率及相对标准偏差(r e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n,R S D,%),考察方法的准确度及精密度㊂1.7.4基质效应绘制甲醇溶剂标准曲线(斜率为K2)和各基质匹配标准曲线(斜率为K1),定义基质因子(m a t r i x f a c t o r,M F)=K1/K2[32]㊂2结果2.1方法线性关系按1.7.1所述方法绘制基质匹配标准曲线,测定结果表明,不同基质中五氯酚的质量浓度与对应的峰面积在定量范围内线性关系良好,饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁水的基质匹配标准曲线相关系数(R2)分别为0.9997㊁0.9994㊁0.9992;饲料与饲料原料㊁饲料添加剂基质中五氯酚线性范围为0.5~ 20μg/k g,养殖用水基质中五氯酚线性范围为12.5~500n g/L(表5)㊂表5不同基质中五氯酚的线性方程㊁相关系数㊁线性范围T a b l e5L i n e a r e q u a t i o n s,c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s,l i n e a r r a n g e s o f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s基质M a t r i c e s线性方程L i n e a r e q u a t i o n相关系数R2线性范围L i n e a r i t y r a n g e 饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s Y=1639.87X+351.750.99970.5~20μg/k g 饲料添加剂F e e da d d i t i v e s Y=3415.14X+1668.320.99940.5~20μg/k g 养殖用水F a r m w a t e r Y=62.96X+173.980.999212.5~500n g/L Y为峰面积,X为折算后样品中五氯酚浓度Yi s t h e p e a ka r e a,a n dXi s t h e c o n c e n t r a t i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n t h e c o n v e r t e d s a m p l e2.2方法检测限㊁定量限㊁基质效应饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁水中五氯酚的L O D分别为0.1μg/k g㊁0.1μg/k g㊁5n g/L,L O Q 分别为0.5μg/k g㊁0.5μg/k g㊁12.5n g/L㊂绘制饲料与饲料原料㊁饲料添加剂㊁养殖用水的基质匹配标准曲线,与甲醇溶剂标准曲线进行比较,测得M F分别为0.62㊁1.29㊁1.19(表6)㊂表6不同基质中五氯酚的检测限㊁定量限㊁基质效应因子T a b l e6L O D,L O Q a n dM Fo f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s基质M a t r i c e s检测限L O D定量限L O Q基质因子M F 饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n g r e d i e n t s0.1μg/k g0.5μg/k g0.62饲料添加剂F e e da d d i t i v e s0.1μg/k g0.5μg/k g1.29养殖用水F a r m w a t e r5n g/L12.5n g/L1.19 24414期朱季升等:高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定猪饲料㊁养殖用水中五氯酚的残留2.3 方法准确度与精密度由表7可知,饲料与饲料原料中五氯酚的回收率为69.80%~93.76%,R S D 为4.31%~9.86%,饲料添加剂中五氯酚回收率为73.16%~96.32%,R S D 为0.89%~5.16%,水中五氯酚的回收率为76.89%~119.50%,R S D 为1.62%~7.23%㊂样品测定准确度与精密度均良好㊂表7 不同基质中五氯酚加标回收率及精密度T a b l e 7 S p i k e d r e c o v e r i e s a n d p r e c i s i o no f p e n t a c h l o r o p h e n o l i nd i f f e r e n tm a t r i c e s 基质M a t r i c e s 加标量S p i k i n g l e v e l 回收率R e c o v e r y /%相对标准偏差R S D/%饲料与饲料原料F e e da n d f e e d i n gr e d i e n t s 0.5μg /k g 69.804.312μg /k g 93.769.8610μg /k g 76.505.89饲料添加剂F e e da d d i t i v e s0.5μg /k g73.165.162μg /k g 77.230.8910μg /k g 96.321.21养殖用水F a r m w a t e r12.5n g/L 76.897.2325n g /L 119.502.7150n g /L 111.281.622.4 实际样品检测使用本研究所建方法对33种猪配合饲料㊁22种饲料原料㊁49种饲料添加剂以及22种养殖用水样品进行分析,其中2种饲料样品中检出了五氯酚,但低于方法定量限,2种饲料添加剂中检出了五氯酚,含量分别为1.8和15.5μg/k ,阳性样品中五氯酚的多反应监测图见图2㊂图2 阳性样品中五氯酚的M R M 监测图F i g .2 M R M m o n i t o r i n g c h r o m a t o g r a mo f p e n t a c h l o r o p h e n o l i n p o s i t i v e s a m pl e s 3 讨 论3.1 前处理条件的优化五氯酚为弱酸性化合物,pK a 为4.73,目前复杂基质中五氯酚的提取主要为酸提取[33]和碱提取[34]两种方式,酸提取是通过调节p H 使五氯酚以酚羟基形式存在,较易溶于有机试剂,碱提取是在碱性条件下,五氯酚的酚羟基发生解离形成阴离子,而易溶于水中㊂MA X 固相萃取柱为混合型阴离子交换柱,在碱性环境中,五氯酚可与MA X 柱填料上的季铵基发生离子交换作用而被保留,可适用于饲料提取液及养殖用水中五氯酚的富集净化㊂本研究所使用的色谱柱p H 耐受范围为2.0~9.0,饲料添加剂的提取液㊁饲料及水样的洗脱液,p H 均超过色谱柱的耐受范围,无法直接检测,需氮吹浓缩复溶处3441中国畜牧兽医51卷理㊂为使五氯酚在色谱柱中良好保留,并考虑色谱柱的p H耐受范围,经试验对比,选用2%甲酸甲醇作为复溶试剂,可获得理想的色谱峰形㊂目前水中五氯酚的检测常使用C18[35]㊁H L B等反相固相萃取柱,而MA X固相萃取柱的应用较少,李丽等[36]使用H L B固相萃取柱对地下水中五氯酚富集净化,检测限为30n g/L;万译文等[17]分别采用H L B固相萃取柱和MA X固相萃取柱对渔业水体和渔业饲料中的五氯酚进行富集净化,检测限分别为50n g/L和0.8μg/k g㊂本研究采用MA X固相萃取柱对水样及饲料中的五氯酚进行富集净化,较现有方法达到了更高的灵敏度,水样及饲料中的五氯酚检测限分别降低至5和0.1μg/k g㊂3.2基质效应的校正在L C-M S检测分析中,由于共流出以及电离竞争抑制现象的存在,往往会使目标化合物的响应信号偏离,存在基质效应[37]㊂基质效应会影响方法的灵敏度㊁精密度及准确度㊂本试验中以M F衡量基质效应,当M F值=1时,表示无基质效应;M F 值<1时,则基质抑制;M F值>1时,则基质增强㊂由本试验测定结果可知,各基质养殖投入品中,存在较强的基质效应干扰㊂目前降低基质效应的方法主要包括稀释样品溶液㊁增加净化步骤㊁优化色谱分离条件㊁采用同位素内标物㊁配制基质匹配标准溶液等,其中采用同位素内标法可准确地消除基质效应带来的影响,但市场上暂无五氯酚同位素内标的售卖,且由于稀释样品溶液㊁增加净化步骤等处理皆会使方法灵敏度和准确性下降,因此为了得到准确结果,减少基质效应对结果的影响,本研究采用绘制基质匹配标准曲线进行定量㊂由本试验结果可知,各基质匹配标准曲线线性关系良好(R2>0.999),精密度及准确度均可满足检测要求,因此采用基质匹配外标法可较好地抵消基质效应对五氯酚定量结果的干扰㊂3.3五氯酚风险监测使用本研究所建方法对配合饲料㊁饲料原料㊁饲料添加剂以及养殖用水等养殖投入品进行筛查,由结果可知,饲料原料和养殖用水中均未检出五氯酚;配合饲料中仅有两份检出五氯酚,且含量较低,低于方法定量限;而饲料添加剂样品存在较高污染风险,其中一些含氯元素的氨基酸盐酸盐及类维生素添加剂中检测到了较高含量的五氯酚,疑似生产过程中引入杂质所产生的副产物,需要进行重点关注㊂4结论本研究采用固相萃取法及H P L C-M S/M S技术建立了猪配合饲料㊁饲料原料㊁饲料添加剂㊁养殖用水中五氯酚检测方法,通过优化前处理条件及仪器条件,该方法在各基质定量范围内线性关系良好,灵敏度高,准确性好,重现性高,加标回收率试验和精密度试验结果均符合相关要求,适用于猪配合饲料等养殖投入品中五氯酚的测定,可应用于五氯酚风险筛查㊂经研究发现含氯添加剂样品较易受五氯酚污染,应当予以关注㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]潘胜东,陈晓红,何仟,等.超高效液相色谱-高分辨质谱确证分析泥鳅体内五氯酚代谢物[J].色谱,2017,35(12):1245-1250.P A NSD,C H E N X H,H E Q,e t a l.C o n f i r m a t i o na n da n a l y s i s o f t h e m e t ab o l i t e s o f p e n t ac h l o r o p h e n o l i nl o a c h e su s i n g u l t r a-p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y-h i g hr e s o l u t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y[J].C h i n e s eJ o u r n a lo f C h r o m a t o g r a p h y,2017,35(12):1245-1250.(i nC h i n e s e)[2]黄轶昕.我国灭螺药物研究和现场应用[J].中国血吸虫病防治杂志,2019,31(6):679-684.HU A N G Y X.R e s e a r c ha n d f i e l da p p l i c a t i o no f s n a i lk i l l i n g d r u g s i n C h i n a[J].C h i n e s e J o u r n a l o fS c h i s t o s o m i a s i sC o n t r o l,2019,31(6):679-684.(i nC h i n e s e)[3] X U Q,A I S,G E G,e t a l.H u m a n h e a l 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t o g r a p h y-t r i p l eq u a d r u p o l e t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y c o m b i n e dw i t hQ u E C h E R S[J].C h i n aF o o dS a f e t y M a g a z i n e,2023,12:45-47.(i nC h i n e s e)[22]陆阳,朱鹏飞,姚誉阳,等.固相萃取-高效液相色谱法测定纸质食品包装材料中五氯酚含量[J].食品安全质量检测学报,2022,13(1):65-71.L U Y,Z HU PF,Y A O Y Y,e t a l.D e t e r m i n a t i o no fp e n t a c h l o r o p h e n o lc o n t e n ti n p a p e rf o o d p a c k a g i n gm a t e r i a l sb y s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n-h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t ya n dQ u a l i t y,2022,13(1):65-71.(i nC h i n e s e)[23]杨霄,李小玲,刘伶俐,等.大体积固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定地表水中的五氯酚[J].湖南师范大学自然科学学报,2021,44(4):119-125.Y A N G X,L IX L,L I U L L,e t a l.D e t e r m i n a t i o no fp e n t a c h l o r o p h e n o l i ns u r f a c e w a t e rb y l a r g e-v o l u m es o l i d p h a s e e x t r a c t i o n,h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y-t a nde m 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高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定猪肉中20种兽药残留量
高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定猪肉中20种兽药残留量谢寒冰;蒋万枫;赵海峰;赵珊【摘要】采用高效液相色谱法(HPLC)和四极杆飞行时间质谱法(TOFMS)联用技术测定了猪肉组织中20种兽药的残留量,包括16种磺胺类药物和4种β-受体激动剂类药物.猪肉样品(2.00 g)用基质固相分散法处理后先后2次用乙腈-甲酸(99+1)混合液(每次20 mL)振荡提取5 min,离心分离后,取其上清液吹氮至近干,用甲醇-水(1+9)溶液1.0mL溶解浓缩物.经过滤后在所选仪器工作条件下进行HPLC-TOFMS 分析.结果表明:20种目标化合物的线性范围均在0.2～400μg·L-1之间,其测定下限(10S/N)在0.4～15 μμg·kg-1之间.在3个浓度水平上用标准加入法进行回收试验,测得回收率在70.4％～109％之间,测定值的相对标准偏差(n=6)在6.7％～19％之间.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2014(050)006【总页数】6页(P702-707)【关键词】高效液相色谱法;四极杆-飞行时间质谱法;兽药;猪肉【作者】谢寒冰;蒋万枫;赵海峰;赵珊【作者单位】青岛市“菜篮子”商品质量监督检测中心,青岛266071;青岛市“菜篮子”商品质量监督检测中心,青岛266071;青岛市“菜篮子”商品质量监督检测中心,青岛266071;青岛市“菜篮子”商品质量监督检测中心,青岛266071【正文语种】中文【中图分类】O652.63中国是畜产品生产消费大国，兽药对养殖业发展起到了重要作用，但也存在滥用问题。
磺胺类药物（SAs）是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物总称，可用于防治畜禽细菌性感染疾病［1］，该类药物能够产生排尿和造血紊乱等副作用［2］。
β－激动剂是一类人工合成药物，因其对人体有危害，我国已将β－激动剂列为禁用药物。
目前，国内外已有很多关于动物组织中磺胺类和β－激动剂类药物的检测研究，主要包括高效液相色谱法［2－3］、高效液相色谱－串联质谱法［4－6］、高效液相色谱－飞行时间质谱法［7－8］和气相色谱－质谱法［9］等。
超高效液相色谱-质谱法同时测定肉制品中8种β-受体激动剂
超高效液相色谱-质谱法同时测定肉制品中8种β-受体激动剂李磊;周贻兵;林野;刘利亚【摘要】目的建立动物源性食品中8种β-受体激动剂的LC-MS/MS检测方法.方法使用乙酸-乙酸铵溶液调节pH为5.2,β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶提取,经固相萃取柱净化、浓缩、定容后采用LC-MS/MS进行分析.结果5～100ng/mL 浓度范围有良好的线性关系,各组分相关系数r＞0.998,加标回收率范围75％～94％.结论该方法灵敏度高、准确、重现性好,适用于肉制品中β-受体激动剂的残留量检测.【期刊名称】《贵州师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(032)002【总页数】5页(P99-103)【关键词】β-受体激动剂;超高效液相色谱-质谱串联法;固相萃取;肉制品【作者】李磊;周贻兵;林野;刘利亚【作者单位】贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所,贵州贵阳550004;贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所,贵州贵阳550004;贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所,贵州贵阳550004;贵州省疾病预防控制中心卫生监测检验所,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R1550 引言β－受体激动剂又名瘦肉精，是一类人工合成药物。
国内外研究表明，β－受体激动剂具有营养再分配作用，可明显提高瘦肉率，因此被广泛添加于畜禽类饲料中以提高瘦肉率［1，2］。
但人体若摄入了具有β－受体激动剂高残留的动物组织，将会出现肌肉震颤、心动过速、心悸、恶心、眩晕和紧张等中毒症状［3］。
为此，国际奥委会将β－受体激动剂列为禁用药物之一，但也有国家允许部分β－受体激动剂作为动物药物使用，例如日本允许将莱克多巴胺使用于动物养殖，但是制定了严格的最高残留量限制［4］。
我国也明确禁止在饲料或动物饮用水中添加克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β－受体激动剂［5］。
因此，建立健全β－受体激动剂的检测分析技术，对于食品安全监测具有重要意义。
超高效液相色谱——串联质谱法测定畜禽肉中多种磺胺类药物残留
－１
※农业科学
农业与技术 ２０２０ꎬＶｏｌ ４０ꎬＮｏ １６ １ ５
瓶内放入适量的上述储备液ꎬ 用甲醇稀释后ꎬ 保存至
离子碰撞能量进行优化ꎬ 通过调节子离子质谱信号丰
方法具有良好的线性关系ꎬ 检出限和定量限分别为 ２μｇｋｇ－１ 、 ５μｇｋｇ－１ ꎮ ８ 种磺胺类药物添加水平为 １０μｇｋｇ－１ 、
２０μｇｋｇ －１ 、 １００μｇｋｇ －１ 时ꎬ 平均回收率 ８４ ０％ ~ １１４ ２％ꎬ 相对标准偏差 ０ ７３％ ~ ７ ９６％ꎮ 该方法操作简易ꎬ 具
２ １ 标准溶液配制
(ＳＭＺ) 、 磺 胺 噻 唑 ( ＳＴ ) 、 磺 胺 甲 基 嘧 啶 ( ＳＭＲ )
瓶内分别放入精确量取的 ８ 种 ＳＡｓ 标准品各 １０ ００ｍｇꎬ 用
己烷、 乙腈、 乙酸铵 ( 色谱纯) ꎻ ６５０℃ 环境下灼烧无
配制 １μｇｍＬ 的混合标准工作液: 在同一容量
哒嗪 ( ＳＣＰ ) 、 磺 胺 嘧 啶 ( ＳＤＺ ) 、 磺 胺 甲 基 异 恶 唑
冷冻离心机ꎻ Ｍｉｌｌｉ － Ｑ 超纯水系统
[１]
ꎮ
８ 种磺胺类药物标准品: 磺胺醋酰 ( ＳＴＤ) 、 磺胺
脱溶剂气温度 ３５０℃ ꎻ 雾化气ꎬ 氮气 ６００Ｌｍｉｎ ꎻ 碰
－１
撞气ꎬ 氩气ꎻ 扫描模式ꎬ 多反应监测模式ꎮ
２ 实验方法
甲噻二唑 ( ＳＴＺ) 、 磺胺二甲异恶唑 ( ＳＩＸ) 、 磺胺氯
１ ４ ２０２０ꎬＶｏｌ ４０ꎬＮｏ １６
农业与技术 ※农业科学
超高效液相色谱———串联质谱法
测定畜禽肉中多种磺胺类药物残留
向 俊
１ 试验材料
Ｂꎬ １０ｍｉｎ—９５％Ｂꎮ
高效液相色谱串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素方法的研究
櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇殱殱殱殱试验研究收稿日期：２０２３ ０７ １１基金项目：浙江省重点研发计划项目（新型兽药研制及耐药性控制技术研发２０２０Ｃ０２０３２）作者简介：侯轩（１９８８－），男，江苏南京人，兽医师，硕士，主要从事兽药饲料畜产品质量安全工作。
通信作者：陆春波，高级兽医师，主要从事兽药、饲料检测相关工作。
高效液相色谱串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素方法的研究侯 轩，陈 凯，裘丞军，虞一聪，王 彬，吴望君，陆春波（浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州３１１９９９）摘要：建立了高效液相色谱 串联质谱（ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳ）同时检测畜禽粪便中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类２６种化合物的方法。
畜禽粪便冷冻干燥粉碎，ＨＬＢ固相萃取柱净化，用ＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳ进行检测。
２６种化合物在５～２００ｎｇ／ｍＬ浓度范围内线性关系良好（ｒ２≥０．９９），回收率在７０．１％～９９．１％之间，日内变异系数范围为１．３％～１３．０％，日间变异系数范围为１．６％～１４．７％，检测限为２～５μｇ／ｋｇ，定量限为５～１０μｇ／ｋｇ。
本方法操作简便，灵敏度高，适用于猪和鸡粪便中２６种化合物的同时测定。
关键词：畜禽粪便；四环素类；磺胺类；喹诺酮类；大环内酯类；高效液相色谱 串联质谱法中图分类号：Ｓ８５９．７９＋６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－７３０７（２０２３）０５－０００１－００７ 目前，畜禽粪便中检测抗生素的方法主要有高效液相色谱法［１ ２］、液相色谱串联质谱法［３ ４］，但关于同时检测四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类药物的方法鲜有报道。
本研究采用高效液相色谱 串联三重四极杆质谱法对四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类２６种化合物进行同时检测，为畜禽粪便中抗生素残留有效监控、粪污无害化处理及资源化利用提供重要的技术支撑。
１ 材料与方法１．１ 试验仪器 高效液相色谱仪、串联三重四极杆质谱仪、冷冻干燥机、电子天平、氮吹仪（Ｎ ＥＶＡＰ）；冷冻离心机、振荡器等。
高效液相色谱-质谱联用技术对食品中兽药残留量检测分析
DOI：10.16661/ki.1672-3791.2017.31.088高效液相色谱-质谱联用技术对食品中兽药残留量检测分析陈敏（蚌埠产品质量监督检验研究院 安徽蚌埠 233000）摘 要:本文采用高效液相色谱，质谱联用技术法提取、净化样品，在采取0.1mol/L缓冲液以及乙腈混合溶液作为提取溶剂时，四环素兽药、喹诺酮类、磺胺类以及金刚烷胺等兽药的回收效果均较好，回收率均能达到要求，解决了四环素类兽药与喹诺酮类以及磺胺类兽药难以在同时进行提取的问题。
关键词：高效液相色谱 质谱联用技术 兽药残留量中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1672-3791(2017)11(a)-0088-02随着现代人们对于健康生活的重视，食品安全问题已经得到更多人群的关注，这对于食品检测工作机构来说，无疑是提出了更大的工作挑战，其将会面临着更大的检测工作量。
因此，如何建立一套快速的兽药残留药物检测方式显得尤为重要。
1 实验部分1.1 仪器与试剂准备的仪器有超高效液相色谱仪、高速离心机、旋涡混合器、超纯水仪以及旋转蒸发仪，准备的试剂有29种兽药，甲酸、乙腈为色谱纯、水为超纯水、吸附剂C18、NH2。
对于以上试剂分别取合适的量进行研究，对于四环素类的兽药溶解以及定容时采用甲醇，对于磺胺类的兽药溶解以及定容时采用乙腈，保存的条件在4℃以下。
分别吸取以上的标准储备液0.25m L于25m L容量瓶，用乙腈来进行稀释并定容，配制成质量浓度为1.0mg/L的混合标准工作液I；分别吸取四环素类兽药标准储备液各0.5m L，吸取金刚烷胺标准储备液0.1mL,分别吸取喹诺酮类以及磺胺类兽药标准储备液各1m L于100m L容量瓶，同样也是用乙腈来进行稀释并定容，配制混合标准工作液II，其中四环素类兽药质量浓度为0.5mg/L，金刚烷胺质量浓度为0.1mg/L，其他兽药质量浓度为1.0mg/L。
1.2 样品前处理方法在50mL离心管中加入2g的标准样品，加入3mL乙腈、2mL 0.1mol/L缓冲溶液，并进行2min旋涡、5min离心，将上清液收集起来放入其他的离心管中。
高效液相色谱-离子阱质谱法测定尿液中β_2-受体激动剂及β-受体阻断剂
・ ｍ （ 国 Ｍｉｉｏ ｅ 司超纯 水器 制备 ） ａ 美 ｌｐ ｒ 公 ｌ 。
＞９ ％）购 自 美 国 Ｔ ｒｎ ｏ ｅｅ ｒｈ ｈ ｍｉａ ８ ｏ ｏ ｔ Ｒ ｓ ａｃ Ｃ ｅ ｃ ｌ Ｉ ｃ ； 伦 普 罗 （ ｌｎ ｒ ｐ ｒｌ 纯 度 ＞９ ％） 克 伦 ｎ．克 ｃｅ ｐ ｏ ｅｏ ， ９ 和 磅 特 罗 （ ｌｎ ｅ ｔｒ ｌ 纯 度 ＞９ ％） 自德 国 Ｅ ｃｅ ｐ ｎｅｏ ， ９ 购 Ｕ
雪等 赛事 中 ， 受 体 阻断 剂也 是禁 用 的兴 奋剂 。 一
， 一
应” ， 这促 使 不 法 分 子 私 下 里 将 其 作 为 饲 料 添 加 剂 使 用 ， 成 畜禽 肌 肉 及 组织 中存 在 不 同程 度 的残 造 留 ， 食用 者 出现 不 同程 度 的 中毒 现 象 ’ 使 。为 此 ， 我 国政 府 已将 盐酸 克伦 特 罗 、 丁胺 醇 、 沙 塞曼 特 罗和
Ｒ ｆｒｎ ｅＬ ｂ ｒｔｒ ； 丙 喘 宁 （ ｔｐ ｏｅ ｅ ｏ ， ｅｅｅ ｃ ａ ｏ ａｏ ｙ 异 ｍｅａ ｒ ｔｒ ｎ １ 纯 度 ＞ ９ ９ 、 布 他 林 （ ｅｂ ｔｌ ｅ 纯 度 ＞ ９ ． ％） 特 ｔｒｕ ａ ｎ ， ｉ ９ ％） 沙 丁 胺 醇 （ ａｂ ｔｍｏ ， 度 ＞９ ％ ） 丙 卡 特 ８ 、 ｓ ｌｕａ ｌ纯 ８ 、 罗 （ ｒ ｃ ｔｒ ｌ纯 度 ＞９ ％） 非 诺 特 罗 （ｅ ｏｅｏ ， ｐ ｏ ａｅｏ ， ９ 、 ｆｎ ｔｒ ｌ
，一
受 体激 动剂 标 准 品 ： 布特 罗 （ ｒｍｂ ｔｒ ｌ 溴 ｂ ｏ ｕ ｅｏ—
超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中4种蛋白酶抑制剂
超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中4种蛋白酶抑制剂吕佳乐; 刘正才; 姚闽娜; 林元地【期刊名称】《《色谱》》【年(卷),期】2020(038)002【总页数】6页(P212-217)【关键词】超高效液相色谱-串联质谱; 固相萃取; 沙奎那韦; 利托那韦; 奈非那韦; 茚地那韦; 鸡肉【作者】吕佳乐; 刘正才; 姚闽娜; 林元地【作者单位】福建农林大学食品科学学院福建福州 350002; 福州海关技术中心福建福州 350001【正文语种】中文【中图分类】O658沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦和茚地那韦是一类高效和高选择性的蛋白酶抑制剂,属于抗病毒类药物[1]。
而病毒缺少完整的酶系统,将无法独立存活,因此它必须侵入易感的宿主细胞,依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸,借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质[2]。
因蛋白酶抑制剂能与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合,使蛋白酶活力下降,甚至消失,从而达到抵抗病毒的作用。
早在2005年,中华人民共和国农业部公告第560号就规定,禁止将人用抗病毒药移植兽用,但为了节约成本,许多不法商家依然将其用于畜禽的预防感染和治疗疾病上。
2012年央视曝光的“速生鸡”事件就是一些养殖企业为快速获得经济利益,缩短鸡的养殖周期,在鸡饲料中违规添加利巴韦林和盐酸金刚烷胺等抗病毒药物。
长期大量使用这些药物,会导致动物中毒,并诱发病毒菌株产生变异,这将严重威胁人类健康[3,4]。
因此,建立鸡肉中蛋白酶抑制剂的残留检测方法非常重要。
目前国内外检测沙奎那韦、利托那韦、奈非那韦、茚地那韦的主要方法有高效液相色谱法[5]、反向高效液相色谱法[6]、高效液相色谱-串联质谱法[7-9]、高效液相色谱-紫外法[10]等。
目前关于这4种药物的报道主要集中在血浆和尿液中药物含量的测定方面,而动物性食品中残留检测方法的报道相对较少。
梁公文等[8]采用反向高效液相色谱-串联质谱法检测小鼠血浆和脑组织中沙奎那韦的含量,操作过程繁琐;时美慧等[11]采用Thermo Hypersil GOLD色谱柱，以正离子模式、选择反应监测(SRM)方式建立了快速测定人血浆中洛匹那韦和利托那韦浓度的LC-MS/MS 方法,但只选取了一对二级碎片离子进行分析和检测;Chi等[12]建立了LC-MS/MS 法测定人血浆中蛋白酶抑制剂的含量,但种类不够全面。
QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中44种食源性兴奋剂和6种孕激素
QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽肉中44种食源性兴奋剂和6种孕激素冯月超;王建凤;侯帆;丁奇;楚弘宇;刘艳【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2022(40)5【摘要】利用QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法建立了畜禽肉中44种兴奋剂和6种孕激素的检测技术。
样品粉碎均质后加入内标,依次加入水和含0.5%乙酸的乙腈溶液振荡提取后,加入氯化钠和无水硫酸镁脱水离心,上清液采用PSA、C_(18)、中性氧化铝和无水硫酸镁分散固相萃取材料进行净化,净化液经氮气吹干,复溶后用超高效液相色谱-串联质谱仪测定。
被测物采用ACQUITY BEHC_(18)(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液和甲醇为流动相分离,在电喷雾正离子模式下,以多反应监测(MRM)方式采集,采用基质匹配标准曲线内标法定量分析。
50个被测物包含6类化合物:β_(2)-激动剂类(19个)、β-阻断剂类(3个)、蛋白同化激素类(11个)、糖皮质激素类(8个)、利尿剂类(3个)、孕激素(6个)。
所有被测物在各自的范围内线性关系良好,相关系数>0.99,β_(2)-激动剂类和β-阻断剂类的线性范围为0.1~20μg/L,糖皮质激素类的线性范围为0.5~200μg/L,蛋白同化激素类、孕激素类、利尿剂类的线性范围为0.2~50μg/L。
方法的定量限范围为0.1~0.4μg/kg。
在低、中、高3个浓度水平下的加标回收率试验中,50种目标化合物在鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉中的平均回收率范围为50.3%~119.9%,相对标准偏差(RSD,n=6)范围为0.42%~15.1%。
采用该法和国标方法(GB/T 21981-2008)同时对市售的9个肉样品(包括3个牛肉、3个猪肉、2个鸡肉、1个鸭肉)进行了比对检测,对检出的氢化可的松、可的松含量采用t检验进行统计学分析,结果表明,两种方法测得的数据没有显著性差异。
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中国科学B辑:化学 2009年 第39卷 第8期: 774~784 774 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留吴永宁①②*, 苗虹①*, 范赛①②, 赵云峰①②①中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100021;②中国农业大学动物医学院, 北京100193* 通讯作者, E-mail: wuyncdc@; miaohong0827@收稿日期：2009-04-26; 接受日期：2009-05-26摘要利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ITMS)以同位素稀释技术测定了肌肉组织中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂. 肌肉样品经5%的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用ESI源正离子模式在选择离子监测(SRM)模式下进行扫描. 以9种经氘代同位素标记的β2-受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的线性范围为5~200 μg/L, 相关系数(r)大于0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为5、10、20 μg/kg的加标回收试验, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, 相对标准偏差在3.2%~25.7%之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词β2-受体激动剂β-阻断剂肌肉检测HPLC-ITMS1引言β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β2-受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等症状. 20世纪80年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量5倍时, 该类药物如克伦特罗、沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用[1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致β2-受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20世纪90年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过500起[4,5], 我国自1998年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他β2-受体激动剂[6], 如沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立β2-受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β-阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期775相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大. 长期食用高残留的动物组织除会造成消费者如焦虑、头痛、食欲减退等精神症状外, 还会造成消费者对药物的依赖性. 因此各国对β-阻断剂类药物在动物饲养中的使用也都有明确的规定[7]. 欧盟的96/23/EC 指令[8]规定动物性食品中不得检出β-兴奋剂类药物残留; 我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐和酯、西马特罗及其盐和酯列为禁止使用的兽药, 并规定在动物性食品中不得检出[9].目前用于测定β2-受体激动剂的方法较多, 多采用包括免疫亲和层析、固相萃取(SPE)以及固相基质萃取(MSPD)等方法进行净化, 通过色谱或色谱与质谱串联的手段进行检测[10~19], 但净化之前多采用β-葡萄糖醛酸酶或其他方式进行酶解, 仅有少数报道采用酸解或碱性水解的方式使目标化合物解离[18,19]; 为了满足快速筛查的要求, 有关免疫分析法(ELISA 、RIA)也有报道, Elliott CT 等人采用酶联免疫法(ELISA)对莱克多巴胺进行了检测[20], 沈建忠等人采用时间分辨荧光免疫分析法 (TR-FIA) 对猪组织中的莱克多巴胺进行检测, 检测限可以达到0.1 μg/kg [21], 但免疫分析方法的单一性, 不适应多残留的检测. 对β-阻断剂的检测方法的报道较少, 主要对环境中的β-阻断剂进行检测, M. Dolores Hernando [22]以LC-MS 测定了污水及地表水中的11个β-阻断剂; Hing-Biu Lee [23]采用基质固相萃取技术测定了废水中的12个β-阻断剂和β2-受体激动剂. 有关动物性食品中的β-阻断剂的测定还未见报道. 本文的目的是建立一种高灵敏、快速的对多种β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物进行同时测定的分析方法, 以满足对市场动物性食品中β-兴奋剂类药物监管的要求.2 实验部分2.1 试剂及标准溶液甲醇、乙酸乙酯(色谱纯, J.T.Baker 公司), 甲酸(纯度为99%, Ameisensaeure 公司), 高氯酸(优级纯, 北京化工厂)、三氯乙酸(优级纯, 北京化学试剂公司)、氢氧化钠(优级纯, 北京化学试剂公司)、浓氨水(优级纯, 天津市东方化工厂); 实验用水均为超纯水,电阻率为18.2 MQ·cm (Millipore 公司超纯水器制备). β2-受体激动剂标准品：溴布特罗(brombuterol- HCl, 纯度>99%), 克伦异磅特罗(clenisopenterol- HCl, 纯度>99%)、克伦赛罗(clencyclohexerol hy- drochloride, 纯度>99.5%)、(clenhexerol, 纯度>99%)、塞布特罗(cimbuterol, 纯度>99%)、马贲特罗(mapenterol hydrochloride, 纯度>99%)购自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, 德国; 马布特罗(mabuterol, 纯度>99.1%)、塞曼特罗(cimaterol, , 纯度>99.5%)购自Boehringer Ingekheim. 沙美特罗(salmeterol, 纯度>98%)购自Toronto Research Chemical Inc., 美国; 克伦普罗(clenproperol, 纯度>99%)、克伦磅特罗(clenpenterol, 纯度>99%)购自EU Reference Laboratory, 德国; 异丙喘宁(metaproterenol, 纯度>99.9%)、特布他林(terbutaline, 纯度>98%)、沙丁胺醇(salbutamol, 纯度>98%)、丙卡特罗(procaterol, 纯度>99%)、非诺特罗(fenoterol, 纯度>98%)、克仑特罗(clenbuterol, 纯度>95%)、莱克多巴胺(ractopamine, 纯度>95.6%)、妥布特罗(tulobuterol, 纯度>98%)、福莫特罗(formoterol fumarate, 纯度>98%)、班布特罗(bambuterol hydrochloride, 纯度>98%)、利托君(ritodrine hydrochloride, 纯度>99%)购自Sigma 公司.β-阻断剂标准品：美托洛尔(metoprolol, 纯度>98%)、拉贝洛尔(labetalol hydrochloride, 纯度>98%)、普萘洛尔(propranolol hydrochloride, 纯度>98%)、倍他洛尔(betaxolol, 纯度>98%)、喷布洛尔(penbutolol sulfate, 纯度>98%)购自Sigma 公司, 美国.氘代同位素标准品：D 7-Cimaterol 、D 6-Salbuta- mol 、D 9-Cimbuterol 、D 7-Clenproperol 、D 5-Ractopa- mine 、D 9-Mabuterol 、D 11-Mapenterol 、D 6-Clenbuterol 购自EU Reference Laboratory, 德国; D 3-Salmeterol 购自Cambridge Isotope Laboratories Inc, 美国.β2-受体激动剂及β-阻断剂标准溶液储备液的配制：精确称取标准品各约0.0100 g, 分别用甲醇溶解并定容至10 mL, 浓度为1000 mg/L, 于−18℃冰箱中保存. 需要时将各标准储备液制成浓度为10 mg/L 的混合标准工作液, 使用时用甲醇稀释成1 mg/L 的混合标准使用液, 使用后置于−18℃冰箱中保存. 氘代同位素标准品, 直接用 1 mL 甲醇溶解, 除D 3-吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留776Salmeterol(1000 mg/L)外制成10 mg/L 的标准溶液, 使用时用甲醇制成1 mg/L 的内标混合使用液, 使用后置于−18℃冰箱中保存.2.2 仪器与设备高效液相色谱-线性离子阱质谱仪(LTQ, Thermo- fisher 公司, 美国), 离心机(Sigma3K-15型, Sigma 公司, 美国), Oasis MCX 固相萃取柱(6 mL, 150 mg, waters 公司, 美国), N2-浓缩仪(N-EVAP, analytical evaporator Associates INC., 美国).2.3 提取精确称取匀浆后的肌肉样品约5.0 g, 加入5%的三氯乙酸溶液10 mL, 涡旋混匀, 置于80℃水浴中加热超声提取30 min, 以10000 r/min 0℃离心10 min, 吸取上清液于25 mL 试管中. 沉淀用5%的三氯乙酸溶液5 mL 再提取一次, 再以10000 r/min 0℃离心10 min. 合并提取液, 待进行净化处理.2.4 净化Waters Oasis MCX 柱(6 mL,150 mg)依次用6 mL 甲醇、6 mL 水活化后, 将提取液上MCX 柱, 弃去流出液, 依次用2 mL 0.1 mol/L 的高氯酸溶液、1 mL 甲醇淋洗, 用6 mL 含5%浓氨水的甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液置于N2-浓缩仪上浓缩至近干, 用1 mL 甲醇-0.1%甲酸水溶液 (10︰90, V ︰V)充分溶解残渣, 将此溶液过0.22 μm 的有机滤膜待进行LC-MS 测定.2.5 基质匹配的标准工作曲线的制备准确吸取1 mg/L 的混合标准使用液, 用初始流动相配比复溶的空白基质溶液制成5、10、20、40、80、160和200 μg/L 的标准系列溶液. 空白基质溶液的制备：称取与试样基质相应的阴性样品5.0 g, 与试样同时进行提取、净化和复溶得到.2.6 仪器条件 2.6.1 液相色谱条件色谱柱：Waters Atlantis ® T3柱, 150 mm×2.1 mm, 3 μm; 流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱, 参考梯度洗脱条件见表1, 流速：250 μL/min, 柱温：30, ℃表1 液相色谱参考梯度条件时间(min) 0.1%甲酸水溶液(%)甲醇(%)0 90 1045 30 7046 5 9547 10 9055 90 10进样量：10 μL.2.6.2 质谱参考条件离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+); 质谱扫描方式：选择离子监测(SRM), 喷雾电压：4 kV; 鞘气流速：35 arb, 辅助气流速：15 arb, 毛细管温度：325℃, 毛细管电压：50 V. 线性离子阱参数: 全扫描目标离子数10000.0; 选择离子监测目标离子数5000.0; 多级质谱目标离子数 (MSn) 5000.0; 精确扫描目标离子数3000.0. 其余质谱参数见表2.3 结果与讨论3.1 样品提取有些β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物在动物组织中会以硫酸轭合物或葡萄糖醛酸轭合物等形式存在, 因此样品要先进行水解, 使待测物游离或从组织中释放已进行后续的提取. 尤其是沙丁胺醇、异丙喘宁等苯酚型药物的轭合物比例较高, 必须经水解后进行提取和净化. 常用的水解方法主要有酶水解[15]、酸水解[18]和碱水解[19]. 本研究采用酸解方式, 一方面三氯乙酸可以起到水解轭合物的作用, 另一方面三氯乙酸具有较强的蛋白沉淀能力, 减少了酶水解中酶制剂本身及其水解后的样品中产生的蛋白类物质对目标化合物的干扰. 样品提取液的 pH 值在3.6~ 4.0之间, 可以直接上经活化后的Waters Oasis MCX 固相萃取柱进行净化.3.2 净化动物源性样品基质较为复杂, 存在着对目标化合物的严重干扰, 本方法采用三氯乙酸提取, 并结合低温高速离心的方式对蛋白物质进行沉淀, 应用固相萃取的方式进行净化. β2-受体激动剂是含氮激素中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期777表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数a)化合物 保留时间(min) 母离子(m /z )对应内标Segment 定量离子(m /z )定性离子(m /z ) 碰撞能量(%)扫描范围(m /z )Metaproterenol 3.15 212 D7-Cimaterol 1 194 152 27 149~215 D7-Cimaterol 5.03 2272 209− 19 206~230 Cimaterol 5.14 220 D7-Cimaterol 2, 3 202−26 199~223Terbutaline 6.13 226 D6-Salbutamol 3 152 170,208 26 149~230 D6-Salbutamol 6.22 2463 228 167,148 18 165~250Salbutamol 6.46 240 D6-Salbutamol 3 222 166 20 163~243 D9-Cimbuterol 9.71 2434 225161 18 155~250 Cimbuterol9.87 234 D9-Cimbuterol 4 21616021 155~240Procaterol 12.14 291 D9-Cimbuterol 5 273 232,216 21 213~295 Fenoterol 12.46 304 D9-Cimbuterol 5 286 135,107 24 105~308 Ritodrine 13.09 288 D7-Clenproperol 5 270 150 21 145~292 Clencyclohexerol 13.46 319 D7-Clenproperol 5 301 − 20 298~323 D7-Clenproperol 15.282706252− 17 248~273 Clenproperol 15.42 263 D7-Clenproperol 6 245 − 22 242~266 D6-Clenbuterol 19.43 283 7 265 204 16 201~286 Clenbuterol 19.60 277 D6-Clenbuterol 7 259 203 22 75~280 D5-Ractopamine 18.99 307 7 289 167 18 165~310 Ractopamine 19.02 302 D5-Ractopamine 7 284 164 21 160~305 Bromchlorbuterol 21.20323 D5-Ractopamine830524916246~326Metoprolol 21.45 268 D5-Ractopamine8 191 116 34 113~271Tulobuterol 22.15 228 D9-Mabuterol 8 154 172 28 150~231 Formoterol 21.94 345 D9-Mabuterol 8 327 149 22 145~350 Brombuterol 22.72 367 D9-Mabuterol 8 349 293 18 290~370 D9-Mabuterol 23.13 3208, 9 30223815 235~325Clenpenterol 23.29 291 D9-Mabuterol 8, 9 273 203 21 200~295 Mabuterol 24.17 311 D9-Mabuterol 9 293 237 20 235~315 Bambuterol26.61 368 D11-Mapenterol 10 312294 20 290~371 Clenisopenterol 27.07 291 D11-Mapenterol 10 273 −21 270~295 D11-Mapenterol 27.46 336 10 31823817 235~340Mapenterol 27.73 325 D11-Mapenterol 10, 11307 237 19 235~330 Labetalol 28.00 329 D11-Mapenterol 11 31120719 205~333Propranolol29.83 260 D11-Mapenterol11 183 116,157 31 113~265 Betaxolol 31.66 308 D11-Mapenterol 11, 12116 177,231 31 113~311 Clenhexerol 33.38 305 D11-Mapenterol 12 287−17 284~310 Penbutolol41.31 292 D3-Salmeterol 13 236201 25 197~295 D3-Salmeterol 41.71 419 13 401383 19 380~422 Salmeterol41.76 416 D3-Salmeterol 13 39838018 375~420a) 碰撞能量(%)为归一化能量; −表示母离子被施予能量打碎后只有一个碎片离子. 分离窗口宽度为2(m /z ), Q 值为0.25吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留778中的苯乙胺类药物, 均具有苯乙醇胺结构的母核, 按照苯环上取代基不同, 常将其分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基, 故通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大, 如结构中具有芳伯氨基, 则多表现为中等极性. 而Waters Oasis MCX 固相萃取柱是具有混合型阳离子交换反相吸附剂的固相萃取柱, 考虑到β2-受体激动剂具有的苯乙醇胺母核及取代基, 在偏酸性情况下对β2-受体激动剂以及β-阻断剂类化合物多能与H +结合形成阳离子, 被MCX 柱的填料吸附, 从而具有高的选择性和灵敏度[14], 起到较好的净化效果.3.3 质谱参数的优化通过流动注射200 μg/L 的以甲醇−0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V )为溶剂的单标标准, 并同时开启液相色谱流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V),流速为250 μL/min, 对碰撞能量及质谱参数如喷雾电压, 毛细管电压、毛细管温度、鞘气及辅助气流速等参数进行了优化, 具体优化结果见2.6.2节的质谱参参数. 经过优化后, 选择离子监测(SRM)模式下, 23 种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂均得到了较高的响 应值.表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数表中Cimaterol 、Clencyclohexerol 、Clenproperol 、Clenisopenterol 、Clenhexerol 的二级质谱碎片均只有一个, 分别为202、301、245、273和287. Shao 等[15]采用waters 公司的三重四极杆质谱测定了猪肝、猪肾及猪肉中的16种β2-受体激动剂, 其中Cimaterol 的质谱碎片离子为159.7和142.7、Clencyclohexerol 的质谱碎片离子为300.9和202.8、Clenproperol 的质谱碎片离子为245和203、Clenisopenterol 的质谱碎片离子为273.0和216.9. 由于离子阱质谱与四级杆质谱的工作原理不同, 对液质联用方法来说常会发生裂解碎片不同的情况, 但本实验中只有一个二级碎片离子不能满足质谱确证的要求. 在今后的实验工作中可以增加二级质谱的碰撞能量或发挥离子阱质谱的优势做三级质谱扫描来解决此问题.3.4 线性方程、检出限及定量限为了更好的降低基质效应的干扰, 本研究采用了基质匹配的标准溶液进行线性实验. 按照2.5配制基质匹配的系列标准系列溶液并注入液质联用仪进行分析, 记录各化合物的色谱峰面积(A )和内标的色谱峰面积(A i ), 以A 和A i 的比值(氘代同位素内标除对应各自的化合物外, 其他化合物按色谱保留时间顺序以相近的氘代同位素化合物为内标)对相应的标准溶液中化合物的浓度进行线性回归计算, 得出线性方程、线性范围和相关系数(r ), 结果见表 3. 由结果可见, 在5~200 μg/L 范围内, 各物质均取得良好线性相关, 相关系数(r )大于0.995. 浓度为80 μg/L 的基质匹配标准溶液的选择离子监测(SRM)的总离子流图见图1, 各化合物的定量离子提取色谱图见图2.采用空白基质加标的方式, 以信噪比(S /N )为3的含量定为方法的检出限(LOD), 以信噪比(S /N )为10的含量定为方法的定量限(LOQ), 23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的检出限及定量限结果列于表 3中.3.5 加标回收实验结果加标回收试验采用空白猪肉样品进行试验, 加标水平分别为5、10和20 μg/kg. 测定结果列于表4中, 加标水平为 5 μg/kg 时, 各化合物的回收率在47.3%~111.5%之间, RSD 在7.2%~23.5%之间; 加标水平为10 μg /k g 时, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, RSD 在4.8%~25.7%之间; 加标水平为20 μg /k g 时, 各化合物的回收率在52.2%~117.7%之间, RSD 在3.2%~23.0%之间. β2-受体激动剂分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大. 且本方法同时检测28种化合物, 加上9个氘代 同位素内标, 共有37个化合物, 从梯度洗脱的液相色谱的保留时间上从3 min 开始出峰到42 min 第37个化合物沙美特罗出峰, 也可以看出各化合物的极性差异, 因此可能在MCX 柱上的保留量和洗脱量会因极性差异而有所不同. 多次试验我们都发现在色谱上最后一个出峰的沙美特罗回收率均较低, 由于沙美特罗取代基类型为水杨醇型, 极性较弱不易与H +结合形成阳离子, 故在MCX 柱上保留较差. 另外加标水平较低为5 μg/kg 时, 受基质效应的影响有些化合物的回收率也较低, 但平行测定结果之间的精中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期779表3 线性方程、相关系数及检出限和定量限化合物 线性方程 相关系数(r ) 检出限(LOD, μg/kg)定量限(LOQ, μg/kg)Metaproterenol Y = 0.0736x + 0.0736 0.99950.100.25Cimaterol Y = 0.0237x + 0.6583 0.9958 0.20 0.50 Terbutaline Y = 0.0869x + 0.0854 0.9971 0.200.90Salbutamol Y = 0.0756x − 0.0092 0.9972 0.05 0.20 Cimbuterol Y = 0.0311x + 0.0100 0.9997 0.20 0.50 Procaterol Y = 0.0508x + 0.0843 0.9957 0.20 1.00 Fenoterol Y = 0.0276x + 0.0048 0.9992 0.20 1.00 RitodrineY = 0.1259x + 0.1179 0.9980 0.15 0.50 Clencyclohexerol Y = 0.0364x + 1.3427 0.9964 0.10 0.20 Clenproperol Y = 0.0379x + 0.0203 0.9992 0.20 1.00 Ractopamine Y = 0.0606x + 0.0253 0.9996 0.20 0.50 ClenbuterolY = 0.0367x + 0.0388 0.9970 0.200.50Bromchlorbuterol Y = 0.0316x − 0.0057 0.9966 0.20 1.00 Metoprolol Y = 0.0249x + 0.0248 0.9991 0.10 0.25 Formoterol Y = 0.0695x + 0.0563 0.9966 0.201.00Tulobuterol Y = 0.0576x − 0.0002 0.9993 0.10 0.20 Brombuterol Y = 0.0393x + 0.0412 0.9982 0.20 1.00 Mabuterol Y = 0.0993x + 0.0831 0.9994 0.20 0.50 Clenpenterol Y = 0.0455x + 0.0697 0.9965 0.20 1.00 Bambuterol Y = 0.0826x + 0.1578 0.9981 0.10 0.20 Clenisopenterol Y = 0.0457x + 0.0834 0.9953 0.20 1.00 Mapenterol Y = 0.0417x + 0.0246 0.9991 0.20 1.00 Labetalol Y = 0.0633x + 0.1315 0.9961 0.20 1.00 Propranolol Y = 0.0307x + 0.0643 0.9964 0.10 0.20 Betaxolol Y = 0.0245x + 0.0486 0.9975 0.10 0.20 Clenhexerol Y = 0.0487x + 0.0912 0.9980 0.20 1.00 Penbutolol Y = 0.1649x + 0.3397 0.9969 0.20 0.50 SalmeterolY = 0.1117x + 0.06710.99580.201.00图1 基质匹配的混合标准溶液(80 μg/L)的SRM 总离子流图1. Metaproterenol;2. Cimaterol;3. D 7-Cimaterol;4. Terbutaline;5. Salbutamol;6. D 6-Salbutamol;7. Cimbuterol;8. D 9-Cimbuterol;9. Procaterol;10. Fenoterol; 11. Ritodrine; 12. Clencyclohexerol; 13. Clenproperol; 14. D 7-Clenproperol; 15. Ractopamine; 16. D 5-Ractopamine; 17. Clen-buterol; 18. D 6-Clenbuterol; 19. Bromchlorbuterol; 20. Metoprolol; 21. Tulobuterol; 22. Formoterol; 23. Brombuterol; 24. Mabuterol; 25. D 9-Mabuterol; 26. Clenpenterol; 27. Bambuterol; 28. Clenisopenterol; 29. Mapenterol; 30. D 11-Mapenterol; 31. Labetalol; 32. Propranolol; 33. Betaxolol; 34. Clenhexerol; 35. Penbutolol; 36. Salmeterol; 37. D 3-Salmeterol.吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留780图2基质匹配的混合标准溶液( 8 0μg / L )的S R M 定量离子提取色谱图中国科学 B 辑: 化学 2009年 第39卷 第8期781表4 β2-受体激动剂及β-阻断剂在猪肉样品中的加标回收实验结果加标水平(5 μg/kg)加标水平(10 μg/kg) 加标水平(20 μg/kg)化合物平均回收率(%, n =6)RSD(%)平均回收率(%, n =6)RSD(%)平均回收率(%, n =6)RSD(%)Metaproterenol 101.3 9.2 70.9 5.3 109.4 7.0Cimaterol 88.6 7.5 91.8 14.6 85.8 13.7Terbutaline 62.3 18.1 95.8 19.1 117.7 3.2Salbutamol 68.0 9.2 107.5 7.7 87.4 4.7Cimbuterol 57.0 8.5 58.2 21.5 93.7 6.0Procaterol 111.5 20.3 102.6 8.2 101.7 10.9Fenoterol 69.8 17.3 79.3 11.3 103.5 16.0 Ritodrine 104.9 9.7 86.3 11.8 100.2 14.1Clencyclohexerol 70.3 12.1 117.8 7.3 112.5 18.7Clenproperol 56.2 11.8 70.9 9.9 81.2 17.2Ractopamine 77.5 14.4 70.5 13.9 86.4 3.9 Clenbuterol 105.8 7.2 85.5 9.8 85.4 6.1Bromchlorbuterol 98.9 17.3 77.7 5.3 88.0 13.3Metoprolol 84.5 7.8 123.7 6.0 99.4 14.2Tulobuterol 51.6 11.3 56.7 11.7 62.3 14.7Formoterol 73.1 11.0 82.8 15.2 84.7 9.6Brombuterol 47.3 8.0 67.3 10.4 79.1 5.0Mabuterol 51.5 17.8 105.4 8.8 100.4 7.1Clenpenterol 53.9 11.0 69.7 8.7 76.2 9.5 Bambuterol 59.6 8.8 118.6 4.8 99.2 9.9Clenisopenterol 51.8 22.4 59.4 14.4 66.5 15.2Mapenterol 47.9 8.5 121.6 6.0 98.4 7.7Labetalol 54.6 9.3 83.3 10.0 76.2 7.7Propranolol 50.5 12.0 81.0 8.6 71.5 7.7Betaxolol 52.0 9.9 122.8 5.5 101.8 6.0Clenhexerol 50.0 20.3 57.2 25.7 59.6 23.0Penbutolol 50.2 14.1 69.0 11.4 66.9 6.3Salmeterol 47.4 23.5 47.3 22.1 52.2 7.7密度良好. 加标回收实验结果表明本方法的精密度和准确度基本良好, 除个别物质外, 基本符合欧盟2002/657/EC [24]对残留检测方法的规定.3.6 实际样品分析利用建立的检测方法, 采集北京地区不同区域、不同市场的猪肉及鸡肉样品进行检测, 只有一例鸡肉样品同时检出克伦特罗(clenbuterol)与莱克多巴胺(ractopamine), 含量分别为2.31和2.17 μg/kg, 未检出其他β2-受体激动剂及β-阻断剂. 其SRM 定量离子提取的色谱图见图 3. 检出率虽然较低, 但暴露出新的问题, 饲料中添加的β2-受体激动剂类药物已由单一添加改为多种药物同时添加, 饲料中单一药物剂量减少, 导致畜禽体内单一药物的蓄积量减少, 而蓄积动物体内的β-兴奋剂类药物种类增多, 造成引起食物中毒的情况并未得到有效缓解, 不同药物的协同毒性可能更甚于单一药物. 因此, 本文建立的灵敏度高, 多组分同时检测的方法, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留782图3 鸡肉样品的SRM定量离子提取色谱图4结论随着克伦特罗与莱克多巴胺在国内外的禁用和监控的加强, 利益的驱使将促进不法分子将其他β2-受体激动剂, 如沙丁胺醇、西玛特洛、溴布特罗等非法添加与动物饲养和饮水中. 除单组分残留测定外, 多组分残留测定方法的建立是β2-受体激动剂残留分析的重要发展方向. 本文建立了HPLC-MS同时检测肌肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的分析方法. 该方法简便快速, 可以同时检测23种β2-受体激动剂和5种β-阻断剂药物残留, 具有较高的灵敏度高, 最低检出限均可以达到0.2 μg/kg, 实际样品在 5 μg/kg的加标水平下基本能达到较好的回收率, 更适用于动物性食品中β-兴奋剂的多残留分析检测, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.致谢本工作得到国家自然科学重点基金(批准号：20837003)和“十一·五”国家科技支撑计划(编号：2006BAK02A27, 2006BAK01A02-5)项目资助, 特此一并致谢.参考文献1 Wellenreiter R H, Tonkinson L V. 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Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Centre for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China;2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, ChinaAbstract: A delicate method has been developed for the simultaneous determination of 23 β2-agonists and 5 β-blockers illegal drugs in muscle tissues by high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spec-trometry using isotope dilution technique. The muscle samples are acid hydrolyzed and extracted with 5% tri-chloracetic acid in water, and then cleaned up using MCX solid phase extraction (SPE) cartridge. Methanol and 0.1% formic acid are used as mobile phases for gradient elution, a Waters Atlantis®T3 column is used for separation, and ESI positive ion scan mode is used with selective reaction monitor(SRM). 9 β2-agonists labeled by the deuterium isotope were used as internal standards for quantification. The linear ranges of 23 β2-agonists and 5 β-blockers are 5~200 μg/L, the coefficient of correlation is not less than 0.995, and the limit of detection for each compound in the muscle tissue is below 0.2 μg/kg. The recoveries of each compound in the spiked samples at three levels 5, 10, 20 μg/kg are in the range of 47.3%~123.7%, and the relative standard deviations are in the range of 3.2%~25.7%. The developed method is sensitive and specific for the determination of β2-agonists and β-blockers in pork and chicken muscle samples.Keywords: β2-agonists, β-blockers, muscle, determination, HPLC-ITMS784。