高效液相色谱_线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中_2_受体激动剂及_阻断剂类药物残留

中国科学B辑:化学 2009年 第39卷 第8期: 774~784

774 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS

高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留

吴永宁①②*, 苗虹①*, 范赛①②, 赵云峰①②

①中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100021;

②中国农业大学动物医学院, 北京100193

* 通讯作者, E-mail: wuyncdc@; miaohong0827@

收稿日期：2009-04-26; 接受日期：2009-05-26

摘要利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ITMS)以同位素稀释技术测定了肌肉组织中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂. 肌肉样品经5%的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用ESI源正离子模式在选择离子监测(SRM)模式下进行扫描. 以9种经氘代同位素标记的β2-受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的线性范围为5~200 μg/L, 相关系数(r)大于0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为5、10、20 μg/kg的加标回收试验, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, 相对标准偏差在3.2%~25.7%之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词

β2-受体激动剂β-阻断剂

肌肉

检测

HPLC-ITMS

1引言

β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β2-受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等症状. 20世纪80年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量5倍时, 该类药物如克伦特罗、沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用[1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致β2-受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20世纪90年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过500起[4,5], 我国自1998年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他β2-受体激动剂[6], 如沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立β2-受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β-阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物

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相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大. 长期食用高残留的动物组织除会造成消费者如焦虑、头痛、食欲减退等精神症状外, 还会造成消费者对药物的依赖性. 因此各国对β-阻断剂类药物在动物饲养中的使用也都有明确的规定[7]. 欧盟的96/23/EC 指令[8]规定动物性食品中不得检出β-兴奋剂类药物残留; 我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐和酯、西马特罗及其盐和酯列为禁止使用的兽药, 并规定在动物性食品中不得检出[9].

目前用于测定β2-受体激动剂的方法较多, 多采用包括免疫亲和层析、固相萃取(SPE)以及固相基质萃取(MSPD)等方法进行净化, 通过色谱或色谱与质谱串联的手段进行检测[10~19], 但净化之前多采用β-葡萄糖醛酸酶或其他方式进行酶解, 仅有少数报道采用酸解或碱性水解的方式使目标化合物解离[18,19]; 为了满足快速筛查的要求, 有关免疫分析法(ELISA 、RIA)也有报道, Elliott CT 等人采用酶联免疫法(ELISA)对莱克多巴胺进行了检测[20], 沈建忠等人采用时间分辨荧光免疫分析法 (TR-FIA) 对猪组织中的莱克多巴胺进行检测, 检测限可以达到0.1 μg/kg [21], 但免疫分析方法的单一性, 不适应多残留的检测. 对β-阻断剂的检测方法的报道较少, 主要对环境中的β-阻断剂进行检测, M. Dolores Hernando [22]以LC-MS 测定了污水及地表水中的11个β-阻断剂; Hing-Biu Lee [23]采用基质固相萃取技术测定了废水中的12个β-阻断剂和β2-受体激动剂. 有关动物性食品中的β-阻断剂的测定还未见报道. 本文的目的是建立一种高灵敏、快速的对多种β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物进行同时测定的分析方法, 以满足对市场动物性食品中β-兴奋剂类药物监管的要求.

2 实验部分

2.1 试剂及标准溶液

甲醇、乙酸乙酯(色谱纯, J.T.Baker 公司), 甲酸(纯度为99%, Ameisensaeure 公司), 高氯酸(优级纯, 北京化工厂)、三氯乙酸(优级纯, 北京化学试剂公司)、氢氧化钠(优级纯, 北京化学试剂公司)、浓氨水(优级纯, 天津市东方化工厂); 实验用水均为超纯水,

电阻率为18.2 MQ·cm (Millipore 公司超纯水器制备). β2-受体激动剂标准品：溴布特罗(brombuterol- HCl, 纯度>99%), 克伦异磅特罗(clenisopenterol- HCl, 纯度>99%)、克伦赛罗(clencyclohexerol hy- drochloride, 纯度>99.5%)、(clenhexerol, 纯度>99%)、塞布特罗(cimbuterol, 纯度>99%)、马贲特罗(mapenterol hydrochloride, 纯度>99%)购自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, 德国; 马布特罗(mabuterol, 纯度>99.1%)、塞曼特罗(cimaterol, , 纯度>99.5%)购自Boehringer Ingekheim. 沙美特罗(salmeterol, 纯度>98%)购自Toronto Research Chemical Inc., 美国; 克伦普罗(clenproperol, 纯度>99%)、克伦磅特罗(clenpenterol, 纯度>99%)购自EU Reference Laboratory, 德国; 异丙喘宁(metaproterenol, 纯度>99.9%)、特布他林(terbutaline, 纯度>98%)、沙丁胺醇(salbutamol, 纯度>98%)、丙卡特罗(procaterol, 纯度>99%)、非诺特罗(fenoterol, 纯度>98%)、克仑特罗(clenbuterol, 纯度>95%)、莱克多巴胺(ractopamine, 纯度>95.6%)、

妥布特罗(tulobuterol, 纯度>98%)、福莫特罗(formoterol fumarate, 纯度>98%)、班布特罗(bambuterol hydrochloride, 纯度>98%)、利托君(ritodrine hydrochloride, 纯度>99%)购自Sigma 公司.

β-阻断剂标准品：美托洛尔(metoprolol, 纯度>98%)、拉贝洛尔(labetalol hydrochloride, 纯度>98%)、普萘洛尔(propranolol hydrochloride, 纯度>98%)、倍他洛尔(betaxolol, 纯度>98%)、喷布洛尔(penbutolol sulfate, 纯度>98%)购自Sigma 公司, 美国.

氘代同位素标准品：D 7-Cimaterol 、D 6-Salbuta- mol 、D 9-Cimbuterol 、D 7-Clenproperol 、D 5-Ractopa- mine 、D 9-Mabuterol 、D 11-Mapenterol 、D 6-Clenbuterol 购自EU Reference Laboratory, 德国; D 3-Salmeterol 购自Cambridge Isotope Laboratories Inc, 美国.

β2-受体激动剂及β-阻断剂标准溶液储备液的配制：精确称取标准品各约0.0100 g, 分别用甲醇溶解并定容至10 mL, 浓度为1000 mg/L, 于−18℃冰箱中保存. 需要时将各标准储备液制成浓度为10 mg/L 的混合标准工作液, 使用时用甲醇稀释成1 mg/L 的混合标准使用液, 使用后置于−18℃冰箱中保存. 氘代

同位素标准品, 直接用 1 mL 甲醇溶解, 除D 3-