7.受体放射分析

表示竞争剂抑制作用强弱的指标有 二个：IC50值和KI。IC50值是指抑制50 ％受体与放射配基结合所需竞争剂的浓 度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。 KI则是指竞争剂的平衡解离常数，KI越 小，表明竞争剂抑制作用越大。
二、双位点系统 一种配基可以和两种以上的受体亚 型结合，每种亚型都有相应的KD值。这 一部分的内容感兴趣的同学自己阅读！
（五）正负协同作用
何谓正负协同作用？它是指当一部分受体与配 基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲 和力逐步下降，称之为负协同作用（如图9－4中曲 线（2）） ，亲和力逐步增大，称之为正协同作用。 （曲线（3））。
（六）受体与配基反应的动力学（ kinetics） 受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数 十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急 剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复 合物的解离也很快（图9－6），这种快速结合和快 速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。
至今，研究受体亲和力和受体数量最基本， 最主要的方法仍然是受体的放射性配基结合分 析（radioligand binding assay of receptors，RBA），简称受体放射分析。它是 应用放射性核素标记配基与特异性的受体结合， 研究受体的亲和力和受体的数量，也是研究受 体亚型的常用方法。 迄今为止，所有已发现的受体 （receptor）都是具有特定氨基酸序列和特定 构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定 的宏观分布（器官和组织特异性）和微观分布 （细胞或细胞核）。
（二）复合物的浓度和配基浓度的关系： 上式展开，重排，得到下式： 可以看出，[RL]和[LT] 并非线性关 系，而是曲线关系，对一定数量（[RT] 固定）和一定亲和力（KD固定）的受体 来说，配基浓度从零开始上升时，复合 物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢， 最后绝大多数受体都变为复合物，也就 是受体被饱和了。这就是饱和曲线 （saturation curve)（图9－1）。
三、受体与配基结合的特性
1、可饱和性（satiability） 每个细胞所
含受体数是有限的，因此配基与受体结合的反应 曲线应该具有可饱和性，受体结合反应呈高亲和 性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容 量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。 2、可逆性（reversibility） 激素、递质 和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体 周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即 配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形 ，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同， 底物经酶作用后变成代谢产物。
一、受体的分类和受体亚型
按受体所在的部位不同分为细胞膜受 体和细胞核受体。每种受体都有特异的内 源性和外源性配基，但是药理实验和放射 配基结合实验发现，不少受体存在两种或 两种以上的亚型。所谓受体的亚型是指受 体分子结构上既有部分相同之处，也存在 部分差别，它们对一定的配基有不同的亲 和力，在生物学上具有各自不同的效应。 受体亚型的区分是生物进化的结果，有利 于机体处理信息的能力及适应性更强。
一般要求配基比活度至少在 3 ． 7 × 1011Bq（10Ci）／mmol以上。另外，配基比 活度高，加入反应管的放射性配基量才有 可能减少，从而有利于用小量标本得到可 靠的数据，并有利降低非特异性结合率。 因为亲和力高，可以减少标 记配基用量，从而既可降低非特异性结合， 又可使放射性配基与受体的结合物解离变 慢，便于进行结合和游离配基的分离。不 仅方便操作，而且获得的数据准确。
NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的 吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此 在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升 高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线（图9 －l）。另外，如果系统中存在大量同种受体的非 标记配基，则放射性的SB被非标记配基取代，而 NSB由于容量很大，空余的位点很多，放射性不被 取代。所以要从TB中减去NSB，最基本的办法是做 一系列平行管，所有的条件都与 TB管相同，只是 多加 100-1000倍量的非标记配基，将SB完全取代 掉，这时的放射性结合即为NSB。由于NSB和放射配 基呈直线关系，多点饱和法的实验中往往只需做34点，再用直线回归法求出其余各点的放射性。
第三节 受体放射分析的基本方法
一、放射性配基的要求
制备优良的放射性配基是受体结合试验的首 要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种 标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：①配 基的特性；②实验目的。
（－）对放射性配基的基本要求
1 、高比活度 组织细胞内的受体浓度一般都 很 低 ， 约 在 104-105 个 ／ 细 胞 ， 或 0.013.0pmol/mg蛋白的水平，而且受体对配基的平衡 解离常数约在 10-9mol/L 上下。因此，低比活度 的配基难于达到分析灵敏度的要求。
3、特异性（specificity）和亲和性（affinity） 受体具有特异识别配基的性能，因此，只有 严格构型和构象的配基分子才能选择性地与受体 结合。受体的特异性还表现在器官或组织（靶器 官）的专一性上，如雌激素对子宫、阴道、乳腺 等器官有兴奋作用，这是因为这些器官上雌激素 受体的数量明显高于非靶器官。受体的亲和性是 指受体和配基的结合能力，受体亲和性高就说明 受体和配基结合的牢固，不容易解离。受体亲和 性的定量指标就是受体的平衡解离常数KD值。受 体的KD值一般在10-8-10-10mol/L之间，KD值在 10-9mol/L以上的受体，一般认为是高亲和性。
曲线的 高度主要反 映受体的数 量多少，曲 线上升的快 慢则主要反 映受体和配 基的亲和力 （亲和力越 高，上升越 快）。
（三）非特异结合（non－specific binding，NSB）上述饱和曲线是受体与配 基的特异结合形成的。这种结合的特点是 低容量（受体的数量不多）和高亲和力， 所以容易饱和。但是，任何受体标本除特 异结合外，还会有一部分非特异结合，当 分离特异结合的复合物测量放射性时，这 部分非特异结合的放射性混在一起，测到 的是总放射性（total binding，TB）， 必需先减去非特异结合（NSB），才能得 到特异结合（specific binding，SB）的 放射性。
（七）竞争性取代反应 （competitive displacement reaction)
在一个受体和放射配基的反应系统中加 入另一个化合物，它若能和受体的配基结 合位点结合，则会与放射配基竞争与受体 结合，最终将表现为放射配基与受体形成 复合物的能力降低（亲和力降低），但受 体数量不变所以叫竞争性取代反应，此时 ，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂 （competitiveagent），它们和受体结合 后不改变受体分子的结构。
Scatchard作图除进行数据处理外， 还能判断一些较复杂的情况。例如，一 般来说，Scatchard作图在下列情况下不 呈直线：①双位点或多位点系统，亦即 受体有两种以上亲和力；②受体有正协 同（nositive cooperatively）或负协 同（negative cooperatively）现象； ③非特异结合的测定所用非标记配基浓 度不对，或把一部分非特异结合也抑制 了，或对特异结合的抑制不完全。
4、与效应的一致性
受体的主要功能是介导配基的生物效应，如 果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生 物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。所以用 生物效应作为观察受体和配基性质的标准是十分 必要的。从配基的角度分析，有的是阳性效应， 有的是阴性效应。阳性效应就是配基与受体结合 后引起阳性生理效应，称为激动剂。阴性效应就 是配基与受体结合后不但不引起阳性生理效应， 而且阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗 剂或阻断剂。
Baidu Nhomakorabea第七章
受体放射分析（ RBA）
第一节 概 论
受体的概念最初是在药理学研究中提出的， 并且进行了大量的研究。自80年代以来，受体 的研究取得了长足的进展，这种进展是与新技 术、新方法的应用分不开的。例如，利用基因 克隆技术测定受体的一级结构，使受体的氨基 酸序列得以阐明，并为确定受体的亚型奠定了 基础。但这些新技术、新方法不能测定受体的 亲和力（KD值）。
虽然受体在总蛋白分子中所占的份额很 小，约为十万到百万分之一，但受体的功能 却十分重要，它接受细胞外的特定信号（神 经递质、激素、某些药物等），通过受体后 特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应， 因此，受体是高等动物适应环境、协调机体 各种细胞功能的关键分子。可以认为，受体 是细胞适应内外环境最重要的门户，在中枢 神经系统中更是信息传递和储存的枢纽。
（四） Scatchard作图（Scatchard plot）
将9－1写成以下形式：KD＝[ RT－RL］[ L] ／「RL]上式重排，得到著名的Scatchard函数：
可以看出，当 RT和 KD固定时，〔RL〕／[ L] 和[RL]是线性关系，也就是说，以［RL］为横 坐标，以「RL」／［L」为纵坐标，将得到一 条直线。这是简单单位点系统的一个重要特征。 横截距即为RT值（当［RL」／［L」＝ 0时， ［RT」＝「RL」），直线斜率的倒数就是KD （图9－3）。
四、受体的生理调节
细胞膜上受体的数量和亲和性随细胞所处的 环境而发生变化。受体的这种生理调节现象与人 体的疾病、药物作用有着密切的关系。受体的生 理调节作用可分为向上调节和向下调节。
1、向下调节（down-regulation）
细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长 期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现 受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现 象，如哮喘病人长期服用β-激动剂产生的耐受性 增高，即药效减弱。
第二节
受体配基结合反应的基本原理
一、简单单位点系统受体与配基相互结合 的基本规律 （一）质量作用定律（mass action law）
对某种受体而言，它的全部受体都以相同的亲和 性以单分子与特定的配基相结合（分子比为1：1 ），而且不表现明显的正负协同作用，理论上讲 结合后产生的生物效应也应完全相同。即为简单 单位点系统。有时，一个受体系统中存在两（多 ）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生 物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相 同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。
2 、高亲和力
3、特异性强 即该配基与所研究受体有选择 性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体 亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的， 所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体 或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。 4、稳定性好 包括标记的稳定性、贮藏时的 稳定性以及温育分析时之稳定性。 从实验目的考虑则主要针对具体研究目标来 选择。例如有的受体有几种亚型，如果实验的意 图是放射性配基要结合所有这几个亚型，即可选 择无亚型选择的配基。相反，想研究其中某一个 亚型，则应选择针对该亚型的高亲和力配基。
2、向上调节（up-regulation）
细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或 长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏 感性增高，表现为增敏，或撤药后反跳现象。如 高血压病人长期服用心得安时对儿茶酚胺增敏， 若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于 受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生 理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研 究病理变化和评价药效的重要内容。
二、跨膜受体的信号传递通路
跨膜受体是含糖或不含糖的蛋白质分子 ，它的主要作用是将细胞外的信号传导到细 胞内，信号再从细胞浆传递到效应器，最后 是一个特定的生物学效应。信号的这种传导 过程称为信号传导通路（signal transudation pathway），它是当今生物学领域中一个重大 的研究课题。受体信号传导的确切通路和机 理至今仍未完全阐明，同学们可参阅“细胞 生物学”等相关课程。
目前，用作受体放射分析的放射性配基多用 3H 、 125I 标记。氚标记配基与原型配基为同型式， 生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求， 且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测 量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多 肽及蛋白质配基多用 125I 标记，其优点是可以达 到较高的比活度。只要很好掌握标记条件（单碘 标记物），仍能保持较好的生物活性。另外，碘 标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。 测量操作简单，所以125I-配基也大量采用。需要 注意的是自行标记125I-配基要解决两个难题：