基因工程的定义

1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

2. 碱抽提法提取质粒DNA 原理和步骤

3、DNA的定量和纯度测定

1. 紫外光谱法

2.琼脂糖凝胶电泳估计

原理：

3.DNA的凝胶电泳的原理

相同分子量的DNA:

闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，

线性分子次之，

伸展开环状最慢。

4. 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。功能

即在核酸分子链的内部制造切口的酶。

自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。

目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点I 型限制性内切酶

II 类限制性内切酶

III类限制性内切酶

粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：5’端凸出（如EcoR I切点）；’端凸出（如Pst I切点）

限制性内切酶识别的序列

1. 长度：一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。

•4个碱基:sau3AⅠ

• 5 个碱基:EcoRⅡ

•6个碱基:EcoRⅠ

•7个碱基:BbvCⅠ

•8个碱基:NotⅠ

限制酶识别序列的结构

大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。有些识别非对称序列，

有些可以识别多种序列，ACCⅠ识别序列是GT MKAC,可以识别4中序列；

有些识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基

位点偏爱(site preferences)

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。

酶切反应条件缓冲液，反应温度，反应时间，反应中止

星星活性(star activity)

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

引起星星活性的因素

①高浓度甘油（>5%）

②酶过量（>100U/ g）

③低离子强度（<25mM）

④高pH (>pH8.0)

⑤有机溶剂

PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane

⑥用其它二价阳离子代替Mg++

Mn++，Cu++，Co++, Zn++

不同的酶对上述条件的敏感性不一样

Pst I比Eco RI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感

同裂酶（Isoschizomers)

识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。

同尾酶(Isocaudamers）

识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等

影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项

1. DNA的纯度

2. DNA的甲基化程度

3. 温度

4. 缓冲液(Buffer)

T4DNA 连接酶的功能

主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA 5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。

大肠杆菌DNA聚合酶I

①一条单链多肽。

②5’→3’外切酶活性位于N端。

5’→3’DNA聚合酶活性

3’→5’外切酶活性

在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得dsDNA 成为平末端。

Klenow fragment

具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。（失去了5’→3’外切酶活性）。

在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。

逆转录酶

依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。

来源RNA肿瘤病毒。

AMV的性质

二链多肽(62kDa/94kDa)

具5’→3’DNA聚合活性

具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)

碱性磷酸酶

该酶可从DNA分子的5’端去除磷酸基

碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5’磷酸，以防止自身连接。

核酸分子杂交定义

用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。

Tm=（G+C）%×0.41+69.3

Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。

核酸探针

1.定义：一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。

为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标