基因工程笔记共20页

1 .什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技

术两个方面谈谈Gene Engineering诞生的基础？

基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。

理论基础：① 1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；

②1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型， 1958年至1972年揭示了先后确立了中心法则，破译了64种密码子

技术基础：①20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA分子进行体外的切割和连接成为可能；

②1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的理想载体，病毒，噬菌体的DNA(或RNA)也可改造成载体

③1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年）

克隆：作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体

（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。

质粒小量提取中,溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用是什么?

溶液Ⅰ是使细胞完全分散溶液Ⅱ是使细胞壁破裂，DNA变性溶液Ⅲ是

使质粒选择性复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双

链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链

的核酸内切酶。

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)限制片段长度多态性：指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的基因组DNA或某一个

基因，会得到不同长度的DNA片段。可用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等

限制性图谱（restriction map):是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。又称物理图谱（physical map)

核酸限制性内切酶的类型及主要特性

特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶

限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能

酶

内切酶的蛋白结

构

3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基

限制作用所需要的辅助因子

ATP、Mg2+和

SAM

Mg2+ ATP、 Mg2+和SAM

寄主特异性位点EcoB：回文序列EcoP1:

识别序列TGA(N)8TGCT

EcoK：

AAC(N)6GTGC （IIs型除外）AGACC

EcoP15:

CAGCAG

切割位点在距离识别位点

至少1000 bp处随

机切开一条单链。位于寄主特异性位点

或其附近

距寄主特异性位

点3‘端

24—26bp处

酶催转换不能能能

DNA易位作用能不能不能

甲基化作用的位

点

寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点

识别未甲基化的

序列进行切割

能能能

序列特异的切割不是是是

基因工程中的用

途

无用十分有用

常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。

主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。2 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。

3. 常用DNA聚合酶的特性比较

DNA聚合酶3’®5’外切

酶活性5’®3’外切

酶活性

聚合速

率

持续能

力

大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低

T4DNA聚合酶高无中低

T7DNA聚合酶高无快高

化学修饰T7DNA聚合酶低无快高

遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高

逆转录酶无无低中

Taq DNA聚合酶无有快高

Taq聚合酶：

TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。最适温度高 75-80 oC 功能缺点，具有5’®3’聚合酶活性和5’®3’外切酶活性，但没有3‘®5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！Taq DNA聚合酶的激活剂金属离子敏感（尤其是Mg2+末端脱氧核苷酸转移酶（terminal transferase）：

特性：

（1） 5’®3’DNA聚合酶活性

①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。

②不需要模板！

③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。

④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物

末端转移酶的用途

（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。

（2）再生酶切位点，便于回收克隆片断。

（3）非放射性标记DNA片断的3’端催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）

S1核酸酶：

特性（1）高度单链特异性（2）反应条件：①低水平Zn2+ ，② pH4.0~4.3、S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。

发卡或有缺口的部位。3）降解限制酶切形成的单链突出端。（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链

. S1核酸酶的用途（1）定位RNA 内切酶位点不能位于内含子序列中！（2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。

pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。

（1）元件来源

①复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点

② Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因

③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。

（2）长度