基因工程笔记共20页
基因工程知识点总结
基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
高二生物基因工程笔记
高二生物基因工程笔记
高二生物基因工程笔记
基因工程是一种通过改变生物体的基因组来改变其性状和功能的技术。
它包括三个核心步骤：选择目标基因、构建基因工程载体和转化目标生物体。
选择目标基因需要根据研究目的和应用需求来确定。
常见的目标基因包括编码特定蛋白质的基因，与特定疾病相关的基因等。
选择合适的目标基因对于实现预期的结果至关重要。
构建基因工程载体是将目标基因插入到载体中。
载体可以是DNA 分子或其他类似分子。
常用的载体有质粒和病毒。
构建载体需要使用酶来剪切和连接DNA片段。
通过构建载体，可以将目标基因引入到目标生物体的细胞中。
转化目标生物体是将含有目标基因的载体引入到目标生物体的细胞中。
转化的方法有多种，常用的包括细胞融合、质粒转化和病毒转导等。
转化后，目标基因就会被目标生物体的细胞所接受和表达。
基因工程的应用广泛。
在农业领域，基因工程可以用来提高作物的抗病性、耐旱性和产量等。
在医学领域，基因工程可以用来治疗遗传性疾病、生产重要药物以及研发新药等。
在工业领域，基因工程可以用来生产高附加值的生物产品，如工业酶和生物燃料等。
虽然基因工程在许多领域中具有巨大的潜力，但也存在一些伦理和安全问题。
在进行基因工程研究和应用时，必须遵循伦理规范和安全标准，确保研究和应用的可靠性和安全性。
总之，基因工程作为一种重要的生物技术，正不断推动科学和技术的发展。
它在农业、医学和工业等领域中有着广泛的应用前景。
我们应该加强对基因工程的学习和研究，发挥其在改善人类生活和推动社会进步中的作用。
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
李林生物有关基因工程大题的笔记
李林生物有关基因工程大题的笔记# 题目。
基因工程是在现代生物学中具有重要意义的技术手段。
请回答下列有关基因工程的问题：（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、______、将目的基因导入受体细胞、______。
（2）在获取目的基因时，常用的方法有从基因文库中获取、______和利用PCR技术扩增目的基因等。
如果要从动物细胞中获取胰岛素基因，一般采用的方法是______。
（3）基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括目的基因、______、______、标记基因等部分。
标记基因的作用是______。
（4）将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、______和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是______；将目的基因导入微生物细胞常用的方法是______。
（5）目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过______才能知道。
检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上，采用的方法是______；检测目的基因是否转录出了mRNA，采用的方法是______；检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用的方法是______。
# 解析。
（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
解析：基因表达载体的构建是为了使目的基因在受体细胞中能够稳定存在并表达；目的基因的检测与鉴定是为了确认目的基因是否成功导入以及是否正常表达。
（2）在获取目的基因时，常用的方法有从基因文库中获取、人工合成法和利用PCR技术扩增目的基因等。
如果要从动物细胞中获取胰岛素基因，一般采用的方法是从基因文库中获取。
解析：人工合成法可以根据已知的基因序列或氨基酸序列合成目的基因；动物细胞中的基因数量众多，要获取特定的胰岛素基因，从基因文库中获取较为合适。
（3）基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
基因工程笔记资料
创建于 2014.10.31
绪论
第一节 基因工程的诞生
第二节 基因工程的安全性
第三节 基因工程的应用
第四节 基因工程技术的商业化发展
一、定义
※ Genetic engineering：
• 在体外将核酸分子
• 插入病毒, 质粒或其它载体系统中 ,构成遗传物质的新组合
• 再整合到那些本来不含该类物质的宿主中
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基因工程课程笔记
创建于 2014.10.31
染色体线性 DNA 和或有缺口的质粒 DNA 变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，
与蛋白质—SDS 复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
所用的试剂作用
① 溶菌酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4 糖苷键。在碱性条
⑨ 酚-氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提 DNA 溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。
但苯酚会残留在 DNA 溶液中。
提取质粒 DNA 的步骤
溶菌 破膜 蛋白质和 DNA 变性 中和 离心除去沉淀 纯化 DNA 沉淀
DNA
溶菌：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。
溶液Ⅰ：
50mM 葡萄糖，
25mM Tris-HCl(pH8.0)，
EK1：在自然环境中一般都要死亡。
EK2：在自然环境中无法存活。
EK3；应该是失去了自我迁移的能力。
（3） 载体的安全
应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌
株中。（容易构建）。如 pMB9，pBR322 等
基因工程的应用 ppt 20 页左右
第一章 基因操作的主要技术原理
膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括 DNA 酶）
基因工程笔记资料
② P2 级实验室 在 P1 级实验室的基础上还装备有
负压的安全操作柜。
③ P3 级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜
④ P4 级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。
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基因工程课程笔记
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具有最高安全防护措施
（2）实验室的生物安全（分 3 级（大肠杆菌）：EK1—EK3 级。）
失。当它与其他
正常核苷酸混
合在同一个扩
增反应体系中
时，在 DNA 多
聚酶的作用下，
虽然它也能够
DNA 聚合酶的活性并增加错配率。
（4）模板（template）① 纯度：但不能有蛋白质变性剂、DNA 酶、Mg2+的螯合剂等
影响 DNA 聚合酶的活性。② 模板的量：不能太多，100l 反应体系中 100ng 足
够。
PCR 技术的扩展
PCR 技术
荧光实时定量 PCR
反向 PCR
不对称 PCR
借助于荧光信号 扩增两个引物外
限制酶切割dna时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸否则限制酶将难以发挥切割活性位点偏爱sitepreference某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏星号活性在极端非标准条件下限制酶能切割与识别序列相似的序列这个改变的特殊性称星号1缓冲液的化学组成mgcl2naclkcl提供mg2和离子强度
结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列
（形成发夹结构）
； ⑤引物的 Tm 值：原始按照计算公式计算，现程序设计。
套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。
基因工程必备知识点共21页PPT
基因工程必备知识点
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
基因工程笔记总结
基因工程笔记总结一、基因工程的概念。
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
又称为DNA重组技术。
（一）基因工程的理论基础。
1. DNA是遗传物质。
- 肺炎双球菌的转化实验和噬菌体侵染细菌的实验证明了DNA是遗传物质，这为基因工程中对DNA的操作提供了理论依据。
2. DNA双螺旋结构和中心法则的确立。
- 沃森和克里克构建的DNA双螺旋结构模型，阐明了DNA的结构特点，为DNA的切割、连接等操作提供了可能。
- 中心法则揭示了遗传信息的传递规律，使得人们能够理解基因表达的过程，从而在基因工程中对目的基因的表达进行调控。
3. 遗传密码的破译。
- 遗传密码的破译使得人们能够根据蛋白质的氨基酸序列推测出相应的DNA序列，反之亦然，这有助于在基因工程中准确获取目的基因并预测其表达产物。
二、基因工程的基本工具。
1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）- 来源：主要从原核生物中分离纯化而来。
- 作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
例如，EcoRI限制酶识别的序列是 - GAATTC -，在G和A之间切开。
- 结果：产生黏性末端（如EcoRI产生的是黏性末端）或平末端。
2. “分子缝合针”——DNA连接酶。
- 类型。
- E.coli DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。
- T4 DNA连接酶：来源于T4噬菌体，既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
- 作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3. “分子运输车”——载体。
- 种类。
- 质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，是基因工程最常用的载体。
- λ噬菌体的衍生物：经过改造后可作为基因工程的载体。
基因工程知识点全
第一章第二章第三章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。
从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。
1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第四章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
具有合适的筛选标记。
分子量小，拷贝数多。
具有安全性。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建（1）删除不必要的DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA 片段的装载量。
一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
基因工程复习笔记
基因工程复习笔记第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。
影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。
2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。
3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。
4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。
分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。
二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。
染料：溴化乙锭（EB）1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。
2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。
SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。
二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。
PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。
（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。
基因工程笔记
加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。
解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。
✧PCR技术的特点：1）高度的灵敏性（1 copy-------- 109）；2）特异性，引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。
（2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3）操作简便易行，PCR扩增法只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
4）用途广泛，生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学。
✧PCR的反应体系和方法：PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。
如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。
1、反应体系（总体积：50-100ul)Buffer 缓冲液dNTP 原料Primer 引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶2、PCR反应条件1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
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1 .什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈Gene Engineering诞生的基础？基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。
理论基础：① 1944年，美国生物学家Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；②1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结构模型， 1958年至1972年揭示了先后确立了中心法则，破译了64种密码子技术基础：①20世纪60年代末70年代初，限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现使DNA分子进行体外的切割和连接成为可能；②1972年首次构建了一个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子如何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等问题。
经研究发现，质粒分子是承载外源DNA片段的理想载体，病毒，噬菌体的DNA(或RNA)也可改造成载体③1973年大肠杆菌转化体系的建立，这实验结果说明基因工程问世，不仅宣告质粒分子可作为基因克隆载体，能携带外源DNA导入宿主细胞，并且证实真核生物基因可转移到原核生物细胞中，并在其中实现功能的表达（基因工程诞生的元年）克隆：作为名词使用时，是指某一个体（或细胞、分子等）通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代（或子细胞、分子等）组成的集体（或群体）；作为动词使用时，指产生上述集体或群体的过程。
质粒小量提取中,溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ作用是什么?溶液Ⅰ是使细胞完全分散溶液Ⅱ是使细胞壁破裂，DNA变性溶液Ⅲ是使质粒选择性复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下来限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)限制片段长度多态性：指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段。
可用于基因组图谱构建、致病基因检测、基因定位、生物进化和分类的研究等限制性图谱（restriction map):是指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。
又称物理图谱（physical map)核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点EcoB：回文序列EcoP1:识别序列TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC （IIs型除外）AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000 bp处随机切开一条单链。
位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。
2 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
3. 常用DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶3’®5’外切酶活性5’®3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DNA聚合酶无有快高Taq聚合酶：TaqDN聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。
最适温度高 75-80 oC 功能缺点，具有5’®3’聚合酶活性和5’®3’外切酶活性，但没有3‘®5’外切酶活性。
因此不能修复错误的碱基配对！Taq DNA聚合酶的激活剂金属离子敏感（尤其是Mg2+末端脱氧核苷酸转移酶（terminal transferase）：特性：（1） 5’®3’DNA聚合酶活性①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。
②不需要模板！③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。
④随机添加的dNTPs。
如果只有一种dNTP，就添加上同聚物末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。
（2）再生酶切位点，便于回收克隆片断。
（3）非放射性标记DNA片断的3’端催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。
（生物素-11-dUTP等）S1核酸酶：特性（1）高度单链特异性（2）反应条件：①低水平Zn2+ ，② pH4.0~4.3、S1核酸内切酶的功能（1）催化单链RNA或DNA降解。
（2）切掉双链核酸中的单链区。
发卡或有缺口的部位。
3）降解限制酶切形成的单链突出端。
（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链. S1核酸酶的用途（1）定位RNA 内切酶位点不能位于内含子序列中！（2）用mRNA测定基因中的外显子序列不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。
pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。
（1）元件来源①复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点② Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。
（2）长度（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。
见图P93（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞® 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet 其中之一中死亡。
外源基因®BamH I ：Amp中存活，但在Tet中死亡外源基因®Pst I：Tet中存活，但在Amp中死亡②分子小，克隆能力大载体越小越好。
>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。
不能通过接合转移。
（6）pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK 质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！（7）PBR322的改进①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。
pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。
②改造EcoR I 位点 pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。
cmlr上也带一个EcoRI位点。
pUC系列University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。
属正选择载体。
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（3）元件来源①复制起点：pBR322的 ori② Ampr 基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。
③ lacZ的启动子：大肠杆菌④ lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的a-肽链序列，是LacZ 的氨基端片断。
（2）长度约2.7kb（3）克隆位点 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端Ti质粒: 存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）天然Ti质粒作载体的缺点（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位点太多。
（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。
（4）在大肠杆菌中不能复制。
. Ti质粒的改造（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。
（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。
（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。
（4）冠瘿碱合成对于植物无意义。
应剔除掉。
（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。
（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。
改造后的Ti质粒载体模式双元质粒载体和共整合载体应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：在体外特异性地扩增某个基因。
可用于目的基因的扩增和分离Primer设计的一般原则：1位置：与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA2引物长度至少16bp,一般引物设计为长15—30bp3引物的碱基序列 3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对4引物的碱基组成 1）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力2）避免连续相同碱基排列或内部回文序列.5避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补6当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。
实际复性温度选择低于Tm值5 oC。
适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现7引物的浓度一般使用终浓度各0.5mmol/L8简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。
需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。
这样的混合引物称简并引物9套嵌引物（nested primers) 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。
增加扩增产物的特异性。
PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸1）DNA模板变性 95oC双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。
（2）DNA模板与引物复性 40-65oC引物（primer）: 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。