1药理药效研究 动物模型

(一)

生物大分子主要包括核酸、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子组成，具有

复杂的空间结构，而且结构与生物活性密切相关。

生物小分子包括游离核苷酸、辅基辅酶、寡糖、寡肽、寡核苷酸、类脂、维生素、信号分子以及许多生物大分子的代谢产物等等。

乳糖操纵子包括：启动子；操纵基因；结构基因(Z, Y, A)

(二)

基因按其功能可分为：结构基因、调节基因、rRNA基因与tRNA基因。

常见的调节基因有microRNAs，siRNAs，piRNAs ……

真核生物的RNA聚合酶(3种)：RNA聚合酶I，II，III。

种类I II III

分布核仁核基质核基质

产物rRNA mRNA, microRNA 5S rRNA, tRNA, siRNA

任一链上的可读框(ORF)方向总是由5，→3，。

原核生物转座因子主要有二类：插入序列(IS)；复合型转座子(Tn)

根据转座的的机制和结果，可将转座分为：复制型转座、保守型转座。

质粒DNA可以有共价闭合环状DNA、缺口的环状DNA、线性DNA三种结构状态。

琼脂糖凝胶电泳时涌动速度的快慢：超螺旋<线性<环状DNA(与分子量有关)

按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制型质粒、松弛控制型质粒。

影响质粒稳定性的因素：①宿主细胞分裂时质粒能否均衡地分配到子代细胞。

②质粒分子自身结构的稳定性。

真核生物基因组可分为细胞核基因组和细胞器基因组。

真核生物基因组存在大量的重复序列：单拷贝序列、中度重复序列(Alu家族)、高度重复序列。

DNA多态性主要包括单核苷酸多态性(SNP)和串联重复序列多态性。

真核基因组的另一特点是存在多基因家族与假基因

真核生物有两类细胞器能携带遗传物质：线粒体和叶绿体。

高等动物线粒体基因组具有独特的特点：①母系遗传；②线粒体DNA损伤后不易修复；

(三) ③遗传密码与通用遗传密码存在差别。

蛋白质组学研究需要两条互补的实验工作流程：基于凝胶的工作流程和基于液相色谱的工作流程。

基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程。

双向凝胶电泳(2-DE)：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。

第一向：等电聚焦IEF；第二向：SDS-PAGE

染色方法：考马斯亮蓝染色；银染(不含戊二醛)；荧光染色(Cy3, Cy5)，放射性同位素标记等。

目前应用最普遍的蛋白质数据库是NRDB 和dbEST 数据库。

典型的真核转录因子都含有二个结构域：DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活结构域(AD)。

(四)

基因工程的工具酶：限制性核酸酶内切酶；DNA聚合酶；DNA连接酶；碱性磷酸酶；核酸酶S1

II型限制酶能识别双链DNA的特定核苷酸序列，并在此序列内有特异的切割位点。

II型限制酶的作用：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。

II类酶识别序列特点---回文结构。切口：平端切口、粘端切口。

DNA-polⅠ具有3种酶活性：①5，→3，聚合酶活性；②3，→5，核酸外切酶活性；③5，→3，核酸外切酶活性。Klenow片段的功能：①补齐双链DNA的3，末端，同时可使3，末端DNA标记同位素；

②在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；③DNA序列分析。

Taq DNA聚合酶具有5，→3，聚合酶活性和依赖于聚合作用的5，→3，外切酶活性。

Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

逆转录酶的功能：①逆转录作用；②核酸酶H的水解作用；③依赖DNA的DNA聚合酶作用。

末端转移酶：底物是单链DNA或有3，突出末端的双链DNA，需要Mg2+参与；

底物是平端或3，凹端的双链DNA，需要Co2+。

末端转移酶的功能：①在载体或目的基因3，末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，

便于DNA重组连接。②用于DNA 3，末端的同位素探针标记。

DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型，两者的辅基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接酶只能连

接粘性末端，而T4 DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。

核酸酶S1的功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。

载体包括克隆载体和表达载体。

常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。

质粒克隆载体的用途：①用于保存和扩增< 2Kb目的DNA。②构建cDNA文库。

③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。

噬菌体：指感染细菌的病毒。按其生活周期分为两种类型：溶菌性噬菌体和溶原性噬菌体。

λ噬菌体的用途：①用作一般的克隆载体；②用于构建基因组或cDNA文库(<22Kb)；

③用于抗体库或随机肽库的构建；④核酸的序列分析。

黏性质粒含有质粒复制的起始位点(ori)、携带抗药基因、用于插入目的基因的单一酶切位点以及λ噬菌体的cos位点。

黏性质粒的用途：①克隆大片段DNA；②构建基因组文库。

外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实。

原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。

原核表达载体调控元件：有启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。

大肠杆菌表达载体中常用的启动子有乳糖启动子(Lac)、色氨酸启动子(Trp)、人工构建的Tac

启动子(Trp-Lac)以及λ噬菌体P L和P R启动子等。

SD序列是核糖体RNA的识别与结合位点。

外源基因在原核细胞中的表达载体分为三型：非融合型表达载体、分泌型克隆表达载体、融合型表达载体。真核表达载体表达元件：有启动子/增强子--克隆位点--终止位点和加poly A信号。

酵母复制型载体是穿梭质粒载体。

目的基因和载体酶切与连接：黏性末端连接、平末端连接、通过同聚尾连接。

(五)

基因诊断的特点：①特异性高；②灵敏度高；③稳定性高；④适用范围广；⑤临床应用前景好。

基因诊断的基本策略：①检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因；

②检测与某种遗传标志连锁的致病基因；③检测表型克隆基因。

基因诊断的基本步骤：获得待检样品；制备和标记核酸探针；基因检测分析。

根据致病基因的遗传方式将遗传性疾病分为：单基因病和多基因病。

根据控制遗传疾病的染色体和基因性质，分为：常染色体遗传、X连锁遗传和线粒体遗传。

基因突变主要包括点突变(转换, 颠换)、片段性突变和动态性突变。

分子诊断的常用技术和方法：核酸分子杂交；基因酶谱；连锁分析；PCR；基因芯片；DNA测序。

探针的种类：基因组DNA探针；cDNA探针；寡核苷酸探针；RNA 探针。

探针的标记方法：放射性同位素标记法、非放射性标记法。

DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术。

基因诊断的基本方法：①基因突变的检测；②多态性分析；③基因表达异常的检测；④外源基因的检测。