转录组测序原理

Unigene GO 分类
Unigene COG 功能分类
基因表达差异分析
N1:total tag Number in sample A
N2:total tag Number in sample B
X :Gene expression level in sample A y :Gene expression level in sample B Reference: Audic S. et al. The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 1997 7(10):986-995
↓
加接头
↓
cDNA的合成
胶回收
真核mRNA的纯化
• mRNA的纯化主要通过磁 珠吸附原理从而分离纯化 • Oligo（dT）25磁珠纯化原 理主要是mRNA的3′的poly A与磁珠在bindingbuffer的 作用下相结合。磁珠通过 MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。 • mRNA与磁珠结合后，再 用Tris-HCL在加热条件下 解离洗脱到溶液中。
Unigene pathway 富集性分析
Pathway富集性分析列表
Thank you
检测报告-合格样品
检测报告-不合格样品
主要内容
• 样品检测
• 文库制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
Biblioteka Baidu
文库制备
第一天 第二天 第三天
消化DNA
↓
末端修复
↓ ↓ A 3’端加 ↓
PCR
↓
mRNA的分离
↓
PCR胶回收
mRNA的打断
转录组测序技术原理
转录本
All transcripts
All mRNAs
主要内容
• 样品检测
• 文库制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
Total RNA样品检测
Agilent 2100 检测
• OD260/280:1.8~2.2 • RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
鉴定基因可变剪接
common reads
exon1
exon2
exon3
mRNA
exon1
exon3
junction reads
exon1
exon2
exon3
鉴定融合基因
新转录本预测
Paired-End (PE) Reads
Paired Reads distribution
Genomic intergenic region Reads cluster
• cDNA 3′末端加A
• Adapter连接
不同方法比较
主要内容
• 样品检测
• 文库制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
主要内容
• 样品检测
• 文库制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
Material
callus root at seedling stage（14d） shoot at seedling stage（14d） flag leaves（2 stages） panicle（3 stages）
• 鉴定出大量新转录本 • 可变剪接鉴定 • 基因融合鉴定
Methods
RNASeq（paired-end & single end） DGE small RNA（18-30 nt）
diol
diol
diol
diol
diol
Flow Cell接头
P7
P5
模板杂交
延长
变性
Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另 •
• •
外一端随机和附近的另外一个引物互补，被 “固定”住，形成“桥”(bridge)。 形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物， 在芯片表面进行扩增，形成双链。 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下 一轮扩增的模板继续扩增反应。 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩 增，成为单克隆“DNA簇群”。
• 测序质量控制：Q20% >80
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化 • 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析
• 基因融合鉴定
有参考基因组序列信息分析流程
Reads 在基因组上的分布
基因结构优化
通过转录组测序鉴定出酵母3’ 和5’ UTR区域 (Nagalakshmi, U. et al.,2008)
主要内容
• 样品检测
• 文库制备 • Cluster Station • Illumina Sequencing • 生物信息分析
生物信息分析
基本信息分析
• 数据量产出：>2Gb per sample • 测序策略：HiSeq2000, PE91 or 101 • 插入片段大小：200 bps
新一代测序技术
Read Length 1×35 bp 2×35 bp 2×100 bp Run Time ~1.5 days ~4 days ~8 days Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
Throughput : up to 25 Gb per day
基于SBS测序技术
3’5’…-5’
G T A T T T T C G G C A C A G A C T C T G G
A T
Cycle 1:按顺序加入反应试剂 合成第一个碱基 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团 Cycle 2-n: 重复前面的步骤
碱基片段杂交
OH
diol
diol
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
mRNA反转录
• 纯化过的mRNA样品加 入1 µ l的fragment buffer 70℃作用1.5min。
• 加入1µ l的stop buffer终止 反应。 • 加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀酶切产 物。
• 末端修复
Genome Res 2010
无参考基因组生物信息分析
• • • • • • Unigene功能注释 Unigene的GO分类 Unigene代谢通路分析 预测编码蛋白框（CDS） Unigene表达差异分析 Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway 富集性分析
De novo reads组装流程
SNP分析
N Eng J Med 2009
Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome
Rice Transcriptome
• 基因功能注释 • 基因结构分析