第二章细胞破碎与提取要点

第2章细胞分离与破碎

BIOSEPARATION ENGINEERING
另外，向含菌体的料液中加入聚丙另外，向含菌体的料液中加入聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝烯酰胺或聚乙烯亚胺等高分子絮凝剂，可使菌体之间产生架桥作用而形成较大的凝聚颗粒。形成较大的凝聚颗粒。凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降，凝聚或絮凝不仅有利于重力沉降，而且还可以在过滤分离中大大提高过滤速度和质量。过滤速度和质量。当培养液中含有蛋白质时．蛋白质时．可使部分蛋白质凝聚而同时过滤除去。同时过滤除去。
1）对滤液进行絮凝或凝聚预处理，改变料液性质 2）在料液中加入助滤剂（如硅藻土）
2 细胞破碎
概述：概述：
BIOSEPARATION ENGINEERING
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外的培养液中，而保留在细胞内。外的培养液中，而保留在细胞内。这类生物产物需用上节所述方法收集菌体或细胞后，进行细胞破碎(cell disruption)，使目胞后，进行细胞破碎，标产物选择性地释放到液相中。标产物选择性地释放到液相中。破碎的细胞或其碎片利用上节所述的固液分离方法(主要是离心法除去后，主要是离心法)除去后方法主要是离心法除去后，上清液用于进一步的分离纯化。步的分离纯化。
BIOSEPARATION ENGINEERING
1.3 过滤
利用薄片形多孔性介质(如滤布)截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法过滤是一种膜分离法
BIOSEPARATION ENGINEERING
滤液的透过阻力主要来自于：过滤介质和介质表面堆积的滤饼滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素提高过滤速度方法：
BIOSEPARATION ENGINEERING

《细胞破碎分离》ppt课件

法
珠捣碎
细胞的大规模处置
超声波法使细胞遭到液体剪适中昂贵细胞悬浮液小规模
切力而破碎
处置
2.非机械法
非机械方法很多 1) 生物法-酶溶解〔enzyme lysis〕 2) 化学法溶胞〔chemical treatment〕 3) 物理法浸透压冲击〔osmotic shock〕冻结和融化〔freezing and thawing〕枯燥法其中酶溶解法和化学溶胞运用最广
大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。
红面包霉菌细胞壁构造：最外层(a)是α-和β-葡聚糖的
混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状构造第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。
真菌细胞壁的构造表示图
真菌细胞壁的强度：主要决议于聚合物的网状构造，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状构造，所以强度更高。
➢ 缺陷： ➢ 超声波产生的化学自在基能使某些敏感性活性
物质失活。 ➢ 对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实
验室小规模细胞破碎中常用。
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果本钱
举例
使细胞遭到液体剪猛烈适中细胞悬浮液大规模
切力而破碎
处置
研磨破碎细胞被玻璃珠或铁猛烈廉价细胞悬浮液和植物
度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等相关。
3〕超声波破碎
作用机理：液体剪切力超声波破碎法
〔Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz 〔千赫〕的超声波探头处置细胞悬浮液。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的频率有关。
超声波破碎的机理

生物工艺学第二章发酵液的预处理与固液分离2

收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，
收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
42
二常见的固液分离方法
过滤离心膜分离双水相萃取 ATPS 扩张床吸附 EBA
43
（一）过滤
过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。
发酵液中的杂质
A.高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
B.杂蛋白
常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞，影响过滤效率。采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化，使两相分离不清。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
4
为何要对发酵液进行预处理？
固液分离方法主要是过滤和离心。对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度
大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大，设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。
24
目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。
25
2）天然有机高分子絮凝剂

生化工艺——第二章细胞破碎

²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎破碎原理：利用在高速搅拌作用下，破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相被破碎。互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。破碎作用遵循一级动力学定律：破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多在实验室使用。在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法机械法技术原理效果成本举例动物组织及动物细胞匀浆法（片型）匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎研磨法超声波法细胞被研磨物磨碎用超声波的空穴作用使细胞破碎适中适中适中便宜适中昂贵细胞悬浮液小规模处理细胞悬浮液大规模处理
匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）须使细胞通过的小孔，的小孔，使细胞受到剪切力而破碎珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生使细胞破碎。极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²

细胞破碎提取总结

细胞破碎提取总结引言细胞是生物体的基本单位，其中包含了许多重要的生物大分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

为了研究细胞内分子的组成和功能，科研人员经常需要将细胞进行破碎提取，以释放细胞内的分子，并进行后续的分析和检测。

本文将对细胞破碎提取的方法进行总结，并讨论其应用和优缺点。

常见的细胞破碎提取方法1. 高压破碎法高压破碎法是一种经典的细胞破碎方法。

它通过将细胞置于高压腔室中，并施加高压力使细胞破碎。

常见的高压破碎装置包括法雷氏破碎器和超声破碎器等。

高压破碎法具有操作简单、成本低廉的优点，适用于一般细胞的破碎提取。

然而，由于高压力对细胞分子的损伤较大，该方法通常需要在低温条件下进行，以减少蛋白质的降解和失活。

2. 酶解法酶解法是利用特定酶对细胞进行破碎和提取的方法。

不同的酶可以针对细胞的不同组分进行选择性酶解。

例如，利用蛋白酶可以将细胞膜蛋白酶解掉，从而得到裸细胞。

酶解法具有选择性强、没有机械刺激的优点，适用于对特定细胞组分的分离和提取。

然而，由于酶的成本较高且容易受到温度和pH等条件的影响，酶解法在实际应用中具有一定的局限性。

3. 化学溶解法化学溶解法是利用化学试剂对细胞进行溶解和提取的方法。

常用的化学试剂包括溶剂、碱性溶液和融解剂等。

化学溶解法具有操作简便、效果稳定的优点，适用于大规模的细胞破碎提取。

然而，由于化学试剂的毒性和对环境的污染问题，该方法在实际应用中需要谨慎选择。

4. 冻融法冻融法是利用冷冻和解冻的循环对细胞进行破碎和提取的方法。

冷冻过程可以使细胞变得脆性，而解冻过程则可以使细胞溶解。

冻融法具有操作简单、对细胞分子的损伤较小的优点，适用于一些对细胞蛋白质活性要求较高的研究。

然而，冻融法需要严格控制冷冻和解冻的速度和循环次数，且对细胞破碎的效果比较不稳定。

细胞破碎提取的应用细胞破碎提取是生物科学研究中的重要步骤，广泛应用于以下领域：1. 蛋白质组学研究细胞破碎提取可以将细胞内的蛋白质释放出来，用于蛋白质组学的研究。

第二章细胞破碎技术PPT课件

碎片分离（离心分离、双水相萃取、膜分离）
提取初步纯化（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）
精制高度纯化（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）
成品加工（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）
2.1 概述 2.2 细胞壁的成分和结构 2.3 细胞破碎技术 2.4 破碎率的评价及破碎率的选择依据
2.1 概述
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄球菌、链球菌。革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
1、细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽聚糖组成，是聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。
综上所述：
不同生物体或同一生物体的不同部位，细胞破碎难易程度不同，因此因采用不同的细胞破碎方法进行破碎。
如：动物器脏细胞没有细胞壁，细胞膜比较脆弱，容易破碎；植物和微生物细胞都具有纤维素、半纤维素或肽聚糖组成的细胞壁，应采用专门的破碎方法进行破碎。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。
除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作用的细胞器。
植物和大多数真菌具有细胞壁。
动物细胞模式图
植物细胞模式图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长时期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。

生物分离工程第二章

此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs
为
s
2
2
d
2 P
(
S
9 L
L)N 2r
或
s
dr dt
Sr
2.N
12
即：
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
13
提高离心沉降速度的主要措施
vs dP 2 (S L ) r 2 18 L
d －颗粒直径； ρS －固体颗粒密度； ρL －液体介质密度； µL－液体介质粘度； ω －旋转角速度； r －转轴中心到颗粒中心距离
第二章细胞分离与破碎
1
总体学习目的和要求
通过本章学习，要求掌握细胞分离和目标产物释放的原理和方法，熟知各种方法的优缺点和应用范围。
2
固液分离的目的
• 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。
• 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。
7
子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团 – 引入外力
8
离心沉降
• 离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。
9
应用
• 1878年瑞典牛奶——奶油 • 1896年用于回收酵母 • 离心分离技术在生工方面主要用于：分
干燥处理
珠磨法撞压击榨法高
压匀浆
超酶溶法声破碎
溶胞作用化学法物理法
44
四、细胞破碎方法及其原理
机械破碎物理破碎
通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

第2章生物样品制备技术

5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等
6、分离条件温和，但是温度需要控制
.
（二）等电点沉淀法
等电点沉淀法利用蛋白质是具不同等电点的两性电解质
，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此
价格昂贵为小分子多肽，在双向电泳结果中出现抑肽素pepstatin在pH9时不能发挥其抑制作用
1 mM EDTA ， 1 mM EGTA
抑制金属蛋白酶
除去影响双向电泳的污染物 :
污染物
样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和其它带电小分子
除杂技术
1、透析 2、旋转透析 3 、凝胶过滤 4 、沉淀 / 重悬法 1、DNase-l RNase-A 2、超速离心 3、超声 TCAI 丙酮沉淀法离心
蛋白质样品处理中经常使用的添加剂:
1、变性剂 (尿素，打开氢键、增溶)
2、去垢剂 (CHAPS ，SDS等，消除疏水基团之间的相互
作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性)
3、两性电解质 (减少蛋白聚合，维持其溶解性)
4、还原剂 (DDT ，二硫苏糖醇，用于打开二硫键) 5、炕基化-SH (保护其不被再氧化)
由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永
逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性
，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验。
常用的分离纯化方法和技术有: 离心法、沉淀法(包括:
盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等)、透析法、色谱法、等电聚焦制备电泳法等。

细胞的破碎与分离ppt课件

和收率高；产品的破坏最少；对pH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。
费用高，通用性差。适用性：小规模的实验室研究。
43
酶法溶胞自溶法 Autolysis
自溶作用是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是
由微生物本身产生的。微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。改变微生物的环境，可诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到自溶目的。
31
JY92-II D超声波细胞粉碎机
32
超声波法Ultrasonication
其原理可能与空化现象(cavitation phenomena)引起的冲击波和剪切作用有关。
空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。
影响因素温度时间 pH缓冲液浓度、细胞代谢途
径等缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变
性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
44
II 化学渗透法 Chemical permeation
化学法用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法化学渗透法
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
39
重要微生物细胞壁的降解酶
40
外加酶法
溶菌酶能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂 EDTA一起使用。

细胞的分离和破碎

第二章细胞分离与破碎 Cell isolation and disruption
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CONTENTS
2.1 发酵液的预处理
壹
请在此添加较简洁标题内容
贰
请在此添加较简洁标题内容
去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等
预处理的具体方法
高价无机离子的去除方法
去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解
度较小，不适合用量较大的场合。
去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。
用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提取。
去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。
杂蛋白质的除去沉淀法盐析调节pH→pI 吸附法加入吸附剂或沉淀剂变性法加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。
胶体双电层的构造
絮凝
指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm）的絮凝团的过程。
絮凝剂的分类
根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：

絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。
3. 机械破碎法与非机械法的比较
比较项目
机械法
非机械法
破碎机理
切碎细胞
溶解局部壁膜
碎片大小
细小
较大
内含物释放
全部
部分
黏度
高（核酸多）
低（核酸少）
时间，效率
时间短，效率高

chapter2细胞分离与破碎2

2.2.4 目标产物的选择性释放
• 利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。
2.2.3 细胞破碎技术
自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。
A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械
法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物
的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的
机械破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
破碎方法的选择
选择的一般原则
2.2.4 目标产物的选择性释放
• 选择性释放目标产物的一般原则
⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和