华南师范大学实验报告

华 南 师 范 大 学 实 验 报 告

学生姓名 林 鸿 锦 学 号 专 业 综合理科二班 年级、班级 07级 课程名称 生物化学实验 实验项目 脂肪酸的β—氧化 实验类型 □验证 □设计 □综合 试验时间 2008 年 11 月 17 日 实验指导老师 陈 文 利 实验评分

一、目的

通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方法及其原理。

二、原理

在肝脏内脂肪酸经β-氧化生成乙酰辅酶A ，两分子乙酰辅酶A 缩合成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：

COCH CH O H CO COOH COCH CH H 2COOH CHOHCH CH HOH CHCOOH CH CH 2H -COOH CH CH CH 332223233223丙酮脱羧丁酸↓+→−−→−-−−−→−=−−→−

剩余的碘可用标准Na 2S 2O 3滴定：

根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。

三、材料、试剂和仪器

（一）材料

新鲜兔肝

（二）试剂

1、0.1%淀粉溶液（溶于饱和NaCl）

2、0.5mol/L丁酸溶液

3、20%三氯乙酸溶液

4、10%氢氧化钠溶液

5、10%盐酸

6、0.1mol/L碘溶液

7、标准0.02mol/L硫代硫酸钠溶液

8、1/15mol/L，pH7.6磷酸盐缓冲液

（三）器具

1、漏斗

2、碘量瓶

3、试管及试管架

4、移液管（5mL，10mL）

5、碱性滴定管

6、恒温水浴锅

四、实验过程

（一）肝匀浆的制备

实验室已准备好新鲜的兔肝匀浆以及煮沸过的兔肝匀浆。（二）酮体的生成

取大试管两支，分别编号，按下表操作。（单位：mL）

现象及分析

溶液呈乳白色，沉淀不明显

（煮沸的时候蛋白质已变性）

有大量暗褐色沉淀（与三氯乙

酸反应，蛋白质变性）

分别过滤，收集滤液，得无蛋白溶液。

加入三氯乙酸前的B试管加入三氯乙酸后（左A右B，A中部分溶液已在过滤）

（三）酮体的测定

取碘量瓶两只，编号后按下表操作。（单位：mL）

碘量瓶编号 A B

加入无蛋白溶液 5.0 5.0

加入0.1mol/L碘液 3.0 3.0

加入10%氢氧化钠溶液 3.0 3.0

放置10min，各瓶溶液均呈浅黄色（碘仿颜色）。再分别滴加10%盐酸3mL，使各瓶溶液中和。

现象及分析红棕色较深（碘较多）红棕色较浅（碘较少）

用0.02mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至碘量瓶中的溶液呈浅黄色，往瓶中滴加0.1%淀粉溶液2-3滴，使瓶中溶液呈蓝色。

起始刻度 2.3 7.9

终止刻度15.1 19.8

消耗量12.8 11.9

加HCl前加HCl后的A瓶加HCl后的B瓶

滴定操作

（四）计算

试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（A-B）×C×1/6

肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=（A-B）×C×1/6×2

1、式中：A为滴定A样品消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数；

B为滴定B样品消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数；

C为硫代硫酸钠的浓度（mol/L）。

2、为什么乘以1/6？

由实验原理中提供的化学方程式可得到以下关系式：

1 CH3COCH3～ 3 NaOI ～ 3 I2～ 6 Na2S2O3

即生成丙酮量是消耗的硫代硫酸钠的1/6。

3、第二条式子为什么多乘了一个2？

过程是这样的：①5g肝脏，加NaCl稀释至10mL→②取用2mL，即1g肝脏→③加各种试剂后体积为10mL→④取用5mL，即0.5g肝脏。

第二条式子要求的是每g肝脏生成丙酮量，而第一条式子求出的为0.5g肝脏生成的丙酮量，因此要乘以2。

4、代入数据计算，试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（12.8-11.9）×0.02×1/6=0.003；肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=0.003×2=0.006

五、实验讨论

（一）注意事项

1、在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。

2、加HCl溶液后即有I2析出，I2会升华，所以滴定迅速，滴定的速度是前快后慢，当溶液

变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴地滴。

3、滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终

点的观察和滴定结果。因为如果过早加入淀粉指示剂会使淀粉与碘产生络合物，而显蓝色。影响碘仿反应的颜色观察。从而影响滴定结果。

（二）为什么说制备新鲜的肝匀浆是本实验的关键？

因为催化酮体生成的酶主要在肝细胞线粒体内膜上，肝脏是酮体生成的主要场所。（三）脂肪酸的β-氧化过程

脂肪酸的活化胞浆中的硫激酶催化中短链脂肪酸活化；内质网膜上的酶活化长

链脂肪酸，生成脂酰CoA，进入内质网用于甘油三酯合成；线粒

体膜上的酶活化的长链脂酰CoA，进入线粒体进入β-氧化。

脂酰CoA进入线粒体长链脂肪酰CoA和载体肉毒碱脂酰转移酶I反应，生成辅酶A和

脂酰肉毒碱，后者进入线粒体内膜。位于线粒体内膜内侧的肉毒

碱脂酰转移酶Ⅱ又使脂肪酰肉毒碱转化成肉毒碱和脂酰CoA，肉

毒碱重新发挥其载体功能，脂酰CoA则进入线粒体基质，成为脂

肪酸β-氧化酶系的底物。

脂肪酸的β-氧化①脱氢(dehydrogenation)反应，生成具有反式双键的α,β-烯脂

肪酰辅酶A。②加水（hydration)反应，生成具有L-构型的β-羟

脂酰CoA。③脱氢反应，生成β酮脂酰CoA。④硫解（thiolysis)

反应，生成乙酰CoA和一个少两个碳原子的脂酰CoA。

（四）脂肪酸β-氧化的生理意义

脂肪酸β-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量。脂肪酸β-氧化也是脂肪酸的改造过程，机体所需要的脂肪酸链的长短不同，通过β-氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸，供机体代谢所需。脂肪酸β-氧化过程中生成的乙酰CoA是一种十分重要的中间化合物，乙酰CoA除能进入三羧酸循环氧化供能外，还是许多重要化合物合成的原料，如酮体、胆固醇和类固醇化合物。

（五）脂肪酸的特殊氧化形式

1、丙酸的氧化

奇数碳原子脂肪酸，经过β-氧化除生成乙酰CoA外还生成一分子丙酰CoA，某些氨基酸如异亮氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的分解代谢过程中有丙酰CoA生成，胆汁酸生成过程中亦产生丙酰CoA。丙酰CoA经过羧化反应和分子内重排，可转变生成琥珀酰CoA，可进一步氧化分解，也可经草酰乙酸异生成糖。

2、α-氧化

脂肪酸在微粒体中由加单氧酶和脱羧酶催化生成α-羟脂肪酸或少一个碳原子的脂肪酸的过程称为脂肪酸的α-氧化。长链脂肪酸由加单氧酶催化、由抗坏血酸或四氢叶酸作供