串联质谱法两种扫描方式检测干血滤纸片上氨基酸含量的精密度和准确度

・５６３・
／∑（ｂｉ％一ｂ％）２
２Ｈ。－Ｖａｌ）购于英国剑桥同位素实验室，甲醇、３ ｍｏｌ／Ｌ盐酸正 丁醇、乙腈均购自德国Ｍｅｅｋ公司，高纯氮气购自北京京高 气体有限公司。 ３．样品测定：按参考文献［３］的方法，首先将标本进行 萃取、衍生化和复溶等步骤的预处理，然后分别采用中性丢 失法和多反应监测法上机检测。 ４．不精密度和不准确度验证实验：根据ＥＰ．１５Ａ文件的 要求ｎ】，每天用中性丢失法和多反应监测法对同一批样本进 行测定，每天测定１次。每批测定包括４个浓度水平，每份 样本重复测定４次，连续测定５ ｄ。记录每天测定结果（ｘ，，
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ Ｃｌｉｎ
［６］Ｔｉｅｂｅｎ
ＬＭ，ｔｅｒ
Ｓｃｈｅｇｇｅｔ Ｊ，Ｍｉｎｎａａｒ
ｔｙｐｅｓ
ｌｉＰ。ｅｔ
ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｃｕｔａｎｅｏｕｓ
ａｎｄ ｇｅｎｉｔａｌ ＨＰＶ
ｉｎ ｃｆｉｍｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ
ｃｏｎｇｅｎｓｉｌ８ ｐｒｉｍｅｎ．Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９３，４２：２６５－２７９． ［７］Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｕｌｅ ＡＪ，Ｐｏｌ Ｒ，Ｆｒａｎｓｅｎ－Ｄａａｌｍｅｉｊｅｒ Ｎ，ｅｔ ａ１．ＧＰ５＋／６ ＋ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｌ＇Ｂｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ
（收稿日期：２眄－１１－３０）
（本文编辑：唐栋）
串联质谱法两种扫描方式检测干血滤纸片上
氨基酸含量的精密度和准确度
李启亮徐樨巍宋文琪
遗传代谢病是指参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜 受体等编码基因发生突变，使其编码的产物功能不良而引发 代谢失常的一组疾病…。许多种类的遗传代谢病已有特效 治疗方法，降低病死率及远期神经系统后遗症发生率依赖于 早期快速诊断前提下的及早干预治疗旧１。国内外的大型实 验室主要通过串联质谱技术来辅助临床医师进行遗传代谢 病诊断¨…。目前，主要应用中性丢失法或多反应监测法检 测氨基酸含量，但国内很少有关于这两种方法检测氨基酸的
４
偏倚标准差（ｓ丽２√型——ｉ『＿，玮＝２０）。分别计
算精密度验证参数和偏倚验证参数：批内精密度验证参数＝
—ａａ—ａＦｘ一４Ｃ，其中ｃ＝２９．８４，ｖ＝１５，仃批内由美国疾病控制中心
２｛ｊｉ端，Ｂ＝ 掣，ｎ＝４，Ｄ＝５。相对偏倚验证参数＝下ｔｘＳ丽ｏ＋ＪＢ，
制中心提供，ｃ＝１２・７６’Ｔ 其中ｔ＝１．９６，，Ｉ－－２０，』Ｂ值由美国疾病控制中心提供。 ５．统计学分析：计算两种方法测定５种氨基酸的Ｓ批内 和Ｓ总，以验证精密度；根据美国疾病控制中心提供的靶值， 分别计算中性丢失法和多反应监测法检测氨基酸结果的相 对偏倚，以验证准确度。 二、结果 １．精密度验证结果：中性丢失法和多反应监测法检测 氨基酸水平精密度验证结果见表１。由表１可知，两种方法 检测到的所有氨基酸精密度结果均在美国疾病控制中心的 允许范围之内，所有结果均可接受。 ２．准确度验证结果：中性丢失法和多反应监测法检测 氨基酸水平准确度结果见表２。由表２可知，两种方法检测 到的所有氨基酸准确度结果均在美国疾病控制中心的允许 范围之内，所有结果均可接受。 三、讨论
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－９１５８．２０１０．０６．０１９ 作者单位：１０００４５首都医科大学附属北京儿童医院检验中心 通信作者：宋文琪，电子信箱：ｓｏｎｇｗｅｎｑｉｌ２１８＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
酪氨酸（Ｔｒｒ）、缬氨酸（Ｖａｌ）。 ２．仪器与试剂：Ｓｈｍａｚｕ ＬＣ－２０Ａ型高效液相色谱仪（日
［２］Ｄｅｌｌ Ｇ，Ｇａｓｔｏｎ Ｋ．Ｈｕｍｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖ／ｒｎｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ
目前国内外对ＨＰＶ进行分型的方法主要采用 以通用引物扩增为基础的检测和ＨＣ．ＩＩ检测技术。 目前常用几种通用引物都设计位于基因组Ｌｌ区保
ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ ｓｃｉ．２００１。５８：１９２３．１９４２．
［３］Ｃｌｉｆｆｏｒｄ
ｍｅｔａ
ＧＭ，Ｓｍｉｔｈ ＪＳ，Ａｇｕａｄｏ
Ｔ。ｅｔ
ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＨＰ、ｒ
ｔｙｐｅ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉａｎ ｉｎ ｈｉ出一ｇｒａｄｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ
ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００３，８９：１０１．１０５． Ｌ，Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ Ａ，Ｂｕｒｋ
方法学评价方面的研究。本文旨在通过分析中性丢失法和 多反应监测法检测干血滤纸片上氨基酸含量的精密度和准 确度性能验证情况，选择最适扫描方式，为实验室开展该项 目检测提供方法学依据。 一、材料与方法 １．标本来源：美国疾病控制中心质控部门提供的 ２００９年度用于大规模室间质评的定值质控纸片，批号分别 为９２１、９２２、９２３、９２４。定值纸片上含有５种定值氨基酸，分 别为蛋氨酸（Ｍｅｔ）、异亮－亮氨酸（Ｌｅｕ—ｔｉｅ）、苯丙氨酸（Ｐｈｅ）、
ＲＤ，ｅｔ
ｃａｎｃｅｒ：ａ
守区段。使用的通用引物有ＭＹ０９／１Ｉ引物∞１和ｃｐ
Ｉ／Ⅱ引物∞Ｊ，另外还有含错配碱基的Ｇｐ５＋／６＋引 物ｒ刊和ＳＰＦ引物哺１等。ＨＣ．ＩＩ是Ｄｉｇｅｎｅ公司的一 种新型ＨＰＶ ＤＮＡ检测技术，该法所使用的是含 ＨＰＶｌ６、１５、３１、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９和６８等 １３种ＨＰＶ型的全长ＲＮＡ探针物一Ｊ。本研究所建 立的ＨＰＶ分型质控品除了ＨＰＶ ＣＰ８３０４外均包含 有不同型别Ｌ１基因全长，ＨＰＶ ＣＰ８３０４为ＭＹ０９／１ｌ 引物扩增产物。国内凯普公司的ＨＰＶ分型试剂可 以区分２１种型别，上海透景公司的试剂盒可以区分 ２６种型别，深圳亚能公司的可以区分２３种型别，北 京金菩嘉公司的可以区分２４种型别等，国内试剂盒 所能区分的型别绝大多数均包含在本研究所建立的 质控品中。因此，该质控品能基本满足不同试剂盒 的评价。根据国际癌症研究协会的研究，ＨＰＶｌ６、 １８、４５、３１、３３、５２、５８、３５、５９、５６、３９、５１、７３、６８、６６等 型别最常见¨０｜，本研究建立了包含３０种不同型别 的ＨＰＶ基因分型质控品包含了所有最常见型别，为 临床实验室质量评价提供了可靠的质控品。
Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｙ，２００２，
１１：１３９４—１３９９．
［１０］Ｍｕｆｉｏｚ
Ｎ，Ｂｏｓｃｈ
ｓ蚰ｊ０８６ Ｓ．ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ
ｔｙｐｅｓ
ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ
ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００３，３４８：５１８－５２７．
提供；总精密度验证参数＝半，其中盯总由美国疾病控
∑Ｘｉ
）【２，ｘ，，Ｘ４），计算每个样本测定结果的批均值瓴＝孕）、每
ｆ
５
／２ｓ２
个批号样本的总均值（詹）以及批内不精密度（ｓ批内＝√警，
∑魄嚼ｄ）２广Ｔ—一 ｓ：＝＿—广）和总不精密度（ｓ总＝√气｝×ｓ氮内＋Ｂ，
Ｓ
∑瓴。一膏）２
法检测每种氨基酸相对偏倚［ｂ；（％）＝捡紫×
本岛津公司），ＡＰｌ２０００型质谱分析仪（美国ＡＢＩ公司），
万方数据
主堡捡笙医堂盘查垫！Ｑ生垒月筮塑鲞筮鱼翅￡坠！』！坐丛鲤：』婴！垫！Ｑ，！些箜：盟璺§ ９６孔板氮吹仪（北京众益中和生物技术有限公司）。５种氨 基酸同位素内标（２Ｈ３．Ｍｅｔ
２Ｈ３．Ｌｅｕ、１３ Ｃ６－Ｐｈｅ、１３ ｃ６－Ｔｙｒ、
ｏｔｈｅｒ ＨＰＶ ｔｙｐｅｓ．Ｊ
Ｄｉｓ，２００１．１８３：８－１５．
ｏｆ ２７
【５］Ｇｒａｖｉｔｔ ＰＥ，Ｐｅｙｔｏｎ ＣＬ，Ａｐｐｌｅ ＲＪ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ ｔｙｐｅｓ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ
ｈｕｍａｎ
ａ
Ｌ１
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ
ｓｉｎｇｌｅ・ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｒｅｖｅｒｓｅ ｌｉｎｅ ｂｌｏｔ Ｍｉｃｍｂｉｏｌ，１９９８。３６：３０２０－３０２７．
・５６２・
主堡捡堕匡堂盘盍垫！Ｑ堡垒旦筮箜鲞筮！期垡堕！』地丛鱼：』！塑垫！Ｑ，！！ｋ塑，堕垒鱼
参 ［１］ｄｅ 考 文 献
对序列中不一致碱基数为１１个。 讨 论
Ｖｉｌｌｉｅｍ ＥＭ，Ｆａｕｑｕｅｔ Ｃ，Ｂｒｏｋｅｒ ＴＲ．ｅｔ ａ１．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍａｅａ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，３２４：１７－２７．
ｏｆ
ａ
ａｎｄ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ
ｈｉｇｈｌｙ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ＰＣＲ—ｒｅｖｅｌ３［，ｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ
ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｎｍｖｉｍｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７：２５０８－２５１７．
中性丢失法检测氨基酸的过程是在样品经过质谱仪的 第一个质量分析器时扫描一定质荷比（ｍ／ｚ）范围的母离子， 在第二个质量分析器扫描丢失了ｍ／ｚ为１０２的中性分子的 子离子（仅限于中性和酸性氨基酸），最终形成一个氨基酸 质谱图１８１；多反应监测法检测氨基酸的过程是在第一个质量 分析器处只允许特定ｍ／ｚ的母离子通过，在第二个质量分析 器处只允许特定ｍ／ｚ的子离子通过，凡符合两次筛选条件时 即可得到一个信号，最终形成一个氨基酸质谱图。目前，对 于质谱法检测氨基酸的推荐扫描方式尚无定论，为了客观的 评价两种方法，本研究采用美国临床实验事标准化协会推荐 的ＥＰ．１５Ａ［７１文件中提供的关于方法学精密度和准确度验证 方案对两种方法做出比较客观的评价。 本研究用于精密度验证的主要指标是批内不精密度和 总不精密度（通常用标准偏差来衡量）。与传统的单批次检 测批内不精密度的方法不同，本研究的批内不精密度指标是 由多次检测的批内标准偏差合并得到，代表着日常条件下的 重复特性，这样可确保评估更有说服力和代表性。而总不精 密度指标虽然需要一些繁琐的计算，但不依赖于评价的天数 和一天内的批数（与传统的方法不同）。在综合考虑了样本 预处理环节、测试物稳定性、携带率和漂移等因素的基础上， 可正确的合并批内、批间和日间的影响，从而使实验设计和 指标的计算更加合理。而准确度的高低则主要以相对偏倚 的大小衡量。通过将检测结果与美国疾病控制中心提供的 验证参数进行比较，以判断精密度和准确度的可接受性。 本研究发现，两种方法检测到的所有氨基酸精密度和准 确度结果均在美国疾病控制中心的允许范围之内，所有结果 均可接受。但总体而言，两者均存在各自的优点和不足。例 如，中性丢失法的优势在于方便、简洁，尤其是检测多种类似 化合物时，其在参数设置方面比多反应监测法简便，对优化 参数时所使用的标准物质的要求不高。但是，中性丢失法的
ｈｉ出来自百度文库ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉＵｏｍａｖｉｒｕｓ
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．２００２。４０：７７９－７８７．
ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．
［８］Ｋｌｅｔｅｒ Ｂ，Ｖａｎ
ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ
Ｄｏｏｍ ＬＪ，Ｓｃｈｍｕｗｅｎ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｂ＝ ４
）。根据美国ＣＤＣ提供的靶值，计算两种方
１００％］、平均相对偏倚（ｂ％＝型一，ｎ＝２０）以及平均相对
表ｌ
一∑ｂｉ％
中性丢失法和多反应监测法检测氨基酸水平精密度结果（ｉｚｍｏＶＬ）
万方数据
・５“・
旦坐捡殓医堂盘盍垫！Ｑ生§旦箍！！鲞筮！翅垡！垫』！坐丛鲤：』！塑垫！Ｑ：！丛塑：盟垒！ 表２ 中性丢失法和多反应监测法检测氨基酸水平准确度结果
［９］Ｃａｓｄｅ ＰＥ，Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ Ｍ，Ｂｕｒｋ
ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ
ｃａｐｔｕｒｅ ２ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ
ＲＤ，ｅｔ
ａ１．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ
ｎｏｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃ
ＣＩ．０６Ｓ—
ｗｉｔｈ
ｈｕｍａｎ
ｔｙｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ
Ｆｘ，ｄｅ ｈｕｍａｎ
【４］ＬｉａｗＫ
ｈｕｍａｎ
ａ１．Ａ １６
ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｙ
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕａ（ＨＰＶ）ｔｙｐｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＤＮＡ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ ｃｈａｉｎ
ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ
ａｎｄ
ｉｔｓ
ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｆｅｃｔ
ｗｉｔｈ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ