碳纳米管的细胞毒性

中国科学 B 辑:化学 2008年 第38卷 第8期: 677 ~ 684 677《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS碳纳米管的细胞毒性诸颖①②, 李文新①*① 中国科学院上海应用物理研究所纳米生物医药实验室, 上海 201800； ② 中国科学院研究生院, 北京 100049 * 联系人: E-mail: liwenxin@ 收稿日期: 2008-02-21; 接受日期: 2008-03-27国家重点基础研究发展规划(批准号：2006CB705605), 国家自然科学基金(批准号：10475109 和 10775168)和上海市纳米专项(批准号：0552nm033, 0652nm016和0752nm021)资助项目摘要 随着碳纳米管(CNTs)的大量生产和应用, 它们对环境和人类健康可能带来不利的影响. 因此, CNTs 的生物效应和安全性研究引起科学家和各国政府的高度重视. 扼要介绍了CNTs 的体外毒性研究的主要结果, 重点讨论了影响CNTs 细胞毒性的诸多因素, 包括CNTs 的种类、所含杂质、CNTs 的长度、直径和长径比、CNTs 水溶性修饰以及细胞存活率的测定方法. 然而, 迄今CNTs 细胞毒性研究取得的实验结果缺少可比性, 分歧也屡见不鲜. 为了更准确地评估CNTs 对人类健康的潜在风险, 我们认为细胞毒性检测中应该充分注意CNTs 的化学修饰以及CNTs 的定量表征等问题, 尤为重要的是要加强CNTs 细胞毒性的物理化学机制研究, 逐步形成具有纳米毒理学自身特点的毒性检测方法和评估标准.关键词碳纳米管(CNTs) 细胞 生物安全性1 引言1991年碳纳米管(CNTs)首次被发现[1]至今, 它们在物理和化学等诸多方面的许多优异性质一直吸引着国内外众多科研人员浓厚的兴趣. CNTs 的巨大应用潜力使它的合成和制备规模不断扩大, 诺贝尔奖获得者和CNTs 研究领域的开拓者Smalley 博士预言, 数年内全世界每年生产的CNTs 将达到数百万 吨[2]. 近年来, 纳米生物安全性研究成为纳米科技研究的主要热点之一. 大量工作投入了CNTs 的生物安全性研究, 而体外细胞毒性评估成为其中一个主要研究内容. 细胞是构成生命的基本单位, 外界任何有害因子对机体的作用, 均可通过细胞形态与功能的改变表现或检测出来. 与动物模型相比, 细胞模型具有较为简单、易于控制实验条件的一致性、实验结果重复性较好等优点. 因此, 大量工作致力于采用细胞模型对纳米管进行安全性和毒性的研究. 但是, CNTs 和普通的化学制剂不同, 其尺度、结构、形貌存在种种差异. 此外, 制备方式, 是否存在制备中的杂质以及对其进行化学修饰的不同都会导致CNTs 细胞生物效应的差异. 因而, 复杂的CNTs 和细胞相互作用必然导致其生物安全性检测结果的复杂性, 多样性和不可预见性. 目前, 国内外已有多篇论文评述了各种纳米材料的毒理学研究[3~12], 但对CNTs 体外安全性研究现状及存在问题单独进行详细总结的文章还未见报道. 本文首先扼要综述CNTs 细胞毒性研究概况, 然后根据研究现状, 提出了进一步研究中值得关注的若干问题和应该开展的研究方向.2 CNTs 的细胞毒性及其影响因素迄今, 纳米材料的细胞毒性分析方法基本沿用诸颖等: 碳纳米管的细胞毒性678传统毒理学检测技术, 这个检测技术常用于在分子水平上的无机和有机化合物, 或天然物质的毒理检测. 近几年来, 已有较多工作致力于CNTs 细胞毒理学研究, 毒性检测结果显示细胞毒性和CNTs 的特征有密切依赖关系. 我们按照CNTs 的特征, 较系统地疏理了大部分文献报道的实验结果.2.1 CNTs 的种类CNTs 主要分成两大类, 单壁纳米管 (SWNTs)和多壁纳米管(MWNTs). 通常认为颗粒的生物学效应与颗粒的粒径和比表面(表面积/质量比)有关, 比表面越大纳米毒理效应越大[13]. SWNTs 有较大的比表面. 管壁间有相对更强的范德华力, 因而常形成纳米管束, 降低了它们有效的比表面积. MWNTs 由多个同轴SWNTs 组成, 比表面略低. 与SWNTs 不同, MWNTs 管壁上存在较多缺陷, 具有较高的化学活性. 实际上合成的MWNTs 管壁上常常带有羧基, 因此, MWNTs 凝聚能力低于SWNTs. 然而根据比表面预测CNTs 的种类对细胞毒性的影响没有想象的那样容易. Jia 等[14]研究了不同的碳纳米材料对肺泡巨噬细胞毒性的影响. 暴露6 h 后, SWNTs 和MWNTs 都使细胞存活率降低, 削弱其吞噬功能, 但质量浓度分析结果指出, 平均直径1.4 nm 的SWNTs 对细胞的毒性远大于平均直径为10~20 nm 的MWNTs. SWNTs 在暴露剂量低至0.38 µg/cm 2时就会引起细胞的严重损伤, 而MWNTs 在暴露剂量高达3.06 µg /cm 2时才导致细胞损伤. 但是, Fiorito 等[15]报道化学气相沉积(CVD)法制备的纯化的SWNTs 和鼠巨噬细胞J771温育72 h, 较少SWNTs 内化进入细胞, 因此对细胞只有很低的毒性, 而该研究中使用的SWNTs 浓度高达30和60 µg/mL. 据我们所知, 目前还没有更多的研究工作报道SWNTs 和MWNTs 细胞毒性的比较, 其中一个可能的原因是在进行CNTs 毒性比较时, 人们不知道使用相同的质量浓度还是相同的总表面积作为标准更为合理.2.2 CNTs 所含杂质在2003年第一个CNTs 细胞毒性研究中, Shve-dova 等[16]研究了未纯化的SWNTs 对人上皮角质细胞(HaCaT)的效应. 该细胞暴露于0.06~0.24 mg/mL SWNTs 18 h, 导致自由基介导的氧化加强、细胞存活率的降低和细胞形态的变化. 他们把观察到的毒性归于未纯化SWNTs 中大量(大约30％)存在的铁催化剂. 市场购买的CNTs 基本上都含有它们生长所必要的金属催化剂, 因此金属催化剂很可能是导致细胞毒性的重要原因. CNTs, 特别是MWNTs, 重金属催化剂往往处于纳米管内部, 毒性分析前用浓酸或混酸纯化的方法不能完全除尽其中的金属杂质. 正如我们实验发现, 市售MWNTs 经混酸(硝酸和硫酸)处理后仍含有0.1% Ni 和 0.2% Fe [17], 金属杂质对细胞毒性的影响不能完全排除. 但是, 迄今并没有直接的实验证据给出令人信服的证明. 相反, 不含金属催化剂的CNTs 依然存在细胞毒性的实验结果已有报道. Monteiro-Riviere 等[18]发现用CVD 法制备的MWNTs (0.1~0.4 mg/mL)在纯化后与人上皮角质细胞(HEK)温育48 h, 导致炎症因子(pro-inflammatory cytokine)的释放和时间-剂量依赖的细胞存活率的降低. 俄歇电子能谱和元素分析不能检测到金属铁催化剂, 因此作者断言纳米管本身有引起潜在皮肤病的危险. 与此相反, 2006年Isobe 等[19]合成了无过渡金属元素的CNTs, 发现它们能被哺乳动物细胞摄取, 但是没有显示明显的毒性. 由于他们合成的纳米管经化学修饰后带有大量氨基, 因而有很好的水溶性. 可能正是纳米管很好的水溶性使其没有明显的细胞毒性.2.3 CNTs 的长度、直径和长径比Sato 等[20]在实验中比较了不同长度MWNTs 的生物效应. 他们通过用不同孔径的滤膜进行多步筛分的方法制备了平均长度分别为220和825 nm 的MWNTs, 发现这两种碳管都能激活巨噬细胞并诱导其表达TNF-α, 表达量之间没有显著性差异. 由于巨噬细胞更容易吞噬较短的MWNTs, 较长的MWNTs 易弯曲缠绕在一起形成凝聚物不利于被巨噬细胞吞噬, 因此, 作者指出较短的MWNTs 更易引起炎症反应. 2004年, 李光等应用体外实验研究MWNTs(直径范围在10~20 nm 、40~60 nm 、60~100 nm)对豚鼠肺泡巨嗜细胞的细胞毒性、尺寸效应和剂量效应, 结果发现, 不同直径MWNTs 具有非常不同的细胞毒性和生物活性, 大直径MWNTs 比小直径MWNTs 可致更严重的细胞毒性[21] .Magrez 等[22]用MTT 法比较了长径比不同的3中国科学 B 辑: 化学 2008年 第38卷 第8期679种碳纳米材料MWNTs(直径20 nm, 长径比80~90), 碳纳米纤维(平均直径150 nm, 长径比30~40), 纳米碳黑(直径数百纳米, 长径比接近1)对人肺癌细胞H546, H446和Calu-1的毒性, 指出这3种碳纳米材料的毒性大小顺序为MWNTs<碳纳米纤维<纳米碳黑. 作者用悬挂键的存在解释毒性与纳米颗粒长径比的依赖性, 认为碳黑表面存在有较高密度的悬挂键, 而对于碳管, 悬挂键优先存在于缺陷部位或管末端. 研究中他们在培养液中使用明胶(gelatin)作为纳米材料分散的稳定剂, 碳纳米材料的暴露浓度仅为0.002~0.2 µg/mL. 我们同样用MTT 法测定了人宫颈癌细胞(Hela)暴露于MWNTs(长度为600 nm, 直径40~100 nm)和3种纳米碳黑(直径分别为14, 20和 51 nm)的存活率, 发现细胞毒性随碳黑的粒径减小而增加, 而MWNTs 可导致显著的细胞毒性, 其值和粒度最小的纳米碳黑相当[23]. 由此可见, 细胞毒性不能简单地和纳米材料的形貌或长径比相联系, 其真正机制值得进一步深入研究.2.4 CNTs 团聚和水溶性修饰和常规化学物质的细胞毒性检测不同, 在CNTs 体外毒性检测中所遇到的一个共同的难题之一就是纳米管的团聚. CNTs 具有超大的分子量, 管壁间很强的范德华力、疏水力和静电相互作用力使纳米管容易团聚成束(bundle), 甚至是微米到数十微米的颗粒(granule). 当细胞暴露于CNTs 的悬浮液时, 团聚而沉降于培养板底部的CNTs 颗粒使细胞毒性检测变得很困难, 而且难以保证结果的重复性和正确性. 为了减少团聚产生的大颗粒, Muller 等[24]将腹膜巨嗜细胞分别温育在含纯化过的MWNTs 和纯化且“研磨” (ground)过的MWNTs 的介质中24 h, 通过乳酸脱氢酶(LDH)释放量分析细胞毒性. 他们指出“研磨”的CNTs 具有剂量依赖的细胞毒性, 并且上调TNF-α, 而 “未研磨”的CNTs 无论是细胞毒性还是TNF-α表达量都低于“研磨”的CNTs. 作者推测其原因是“未研磨”的CNTs 的团聚使细胞对纳米管的可利用程度 降低.为了消除或减轻CNTs 的团聚和沉降对细胞毒性分析的影响, 研究人员通过在纳米管上连结各种亲水性化学基团, 以获得能在水溶液中稳定分散的纳米管悬浮液, 这就是CNTs “水溶性”功能化的修饰. 最常见也是最方便的水溶性修饰是将CNTs 在浓酸中进行回流. 氧化反应使CNTs 两端和管壁上连接数量不等的羟基和羧基, 从而改善它们的水溶性. 近期CNTs 的细胞毒性研究, 特别对纳米管作为药物载体的细胞毒性研究中, 大多采用这种方法进行纳米管的水溶性功能化处理. 例如, Kam 等[25]将SWNTs 用2.5 mol/L 浓硝酸回流氧化并超声处理, 得到的纯化切短且功能化的SWNTs 以50 µg/mL 浓度与人早幼粒白血病细胞HL60温育, 24 h 和48 h 没有发现明显的细胞死亡, 表明功能化SWNTs 本身对HL60细胞没有毒性. 该研究组的另一项工作也得到了类似的结果, 他们用上述浓酸回流方法处理纳米管, 然后0.025 mg/mL SWNT-蛋白复合物与HL60细胞温育24 h 后, 用MTS 法连续观察5天, 发现细胞的增殖情况和对照组相比没有显著差异, 说明内化的纳米管不影响细胞的增殖和存活率[26]. 在另外一些研究中, Dumortier 等[27]利用1,3-偶极环加成反应和氧化/氨基化处理分别制备了两类功能化CNTs, 发现这两类CNTs 都能被B 淋巴细胞, T 淋巴细胞和巨噬细胞摄取. 高水溶性的CNTs 不影响免疫细胞的功能活性; 水溶性稍差的一种功能化纳米管也能保持淋巴细胞的功能活性. Isobe 等[19]的研究中发现, 无过渡金属元素的CNTs 在液氨回流条件下用NaNH 2处理3 h 后全部转化为修饰有氨基的水溶性CNTs, 且在CNTs 浓度为0.1 mg/mL 时对细胞不显示毒性效应, 在暴露浓度高达1 mg/mL 时其细胞毒性也只有25%, 该毒性只有相同质量石英颗粒的十分之一. 因此, 这些实验结果得到的一致认识是纯化的, 水溶性较好的短的CNTs 基本没有细胞毒性[26].我们实验室制备了水溶性较好的MWNTs(长度约600 nm, 直径 40~100 nm), 评估了对Hela 细胞的生物安全性, 发现具有浓度依赖的细胞毒性. 实验进一步指出, 培养液中的血清蛋白有利于MWNTs 的分散, 当MWNTs 分散在含血清的培养液介质中时, 细胞毒性低于其分散于无血清的培养液[23], 结果支持水溶性较好的纳米管有较低细胞毒性的观点.但是, 相反的结果也有报道. Magrez 等[22]指出MWNTs 在用酸处理后毒性增加, 他们认为, 在纳米管上嫁接了可能“有毒的“化学基团包括羰基、羧基和诸颖等: 碳纳米管的细胞毒性680羟基等, 导致细胞的存活率降低. 与此相似, Bottini 等[28]在MWNTs 导致T 淋巴细胞凋亡的研究中发现原形MWNTs 毒性较低, 而纯化后的MWNTs 细胞毒性增加. 该实验中MWNTs 的暴露浓度为400 µg/mL. 他们的解释是浓酸氧化后, MWNTs 在培养液中的溶解度增加导致其在同样的质量体积浓度下具有更高浓度的游离纳米管. 但是, 上述两种解释都没有更多的实验支持.2.5 细胞存活率的测定方法目前, 常用的碳纳米管细胞存活率检测方法大致有如下几种：台盼兰染色直接计数法[28], MTT 染色后测紫外吸收法[29], 碘化丙啶(PI)染色后用流式细胞仪计数细胞存活率[27], 以及Bradford 法测蛋白浓度间接指示细胞存活率方法[19]. 每种检测方法都各有其优缺点. MTT 法是目前细胞毒性检测中最常用的方法, 该法的基本原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物(MTT)由黄色还原为兰色的甲臜结晶, 后者溶于有机溶剂(如二甲亚砜、酸化异丙醇等), 甲臜产量与细胞活性成正比, 可用酶标仪测定其OD 值, 从而获得细胞存活率资料. 但是, CNTs 和一般的化学试剂不同, 具有极大的比表面积和较高的化学活性, 很容易和染料分子发生相互作用而使实验结果偏离真值. 2006年, Wörle-Knirsch 等[29]用不同的方法比较了SWNTs 和人上皮细胞A549温育24 h 后的细胞毒性, 结果发现MTT 法测得细胞毒性高达50%, 而用WST, LDH 等方法则几乎检测不到其对细胞具有毒性. 用透射电镜对实验过程中的SWNTs 的形貌进行观察, 发现在MTT 法测存活率的过程中, 生成的甲臜结晶容易和纳米管相互缠绕在一起, 不易被有机溶剂溶解, 因此得到很多错误的假阳性结果. PI 是一种使死细胞着色而活细胞拒染的染料, 细胞悬液经染色后使用流式细胞仪检测其存活率, 该法快速简便, 但碳纳米材料同样可能由于吸附而和染料分子发生相互作用. 因此, Hurt 等[6]指出, CNTs 等碳纳米材料具有很大的比表面积, 很容易和各种染料分子、荧光试剂等发生非特异性的吸附, 在对目前存在的大量的超细碳颗粒进行细胞毒性评估或建立毒性评估方法时, 一定要十分重视这个问题.以上环绕CNTs 的特性扼要总结了有关纳米管细胞安全性及毒性评估的实验资料, 总体说来, 这些资料仍然是零乱的, 很多实验结果之间缺乏可比性甚至是是彼此矛盾的. CNTs 作为一维纳米材料, 本身不是一个简单的分子, 它的大小、组成和结构都不是唯一的, 无法像普通化学分子那样, 用组成和结构唯一确切地鉴别其完全等同性. 此外, 人为的化学修 饰, 又增加了它们的多样性. 纳米管的复杂性还表现在实验研究中无法只变化它们的一个特性, 而同时保证其他特性都维持不变, 以致实验中难以得到它们的某一种特性与细胞毒性的关系. 例如, CNTs 在强酸回流和超声处理的过程中, 它们的长度、杂质含量和功能化都同时在变化. 迄今研究中发现的问题比了解到的问题还要多, 因此大量的研究工作有待进一步开展和深化.3 值得关注的问题我们课题组从事碳纳米材料, 包括富勒烯, MWNTs 和纳米碳黑的生物效应和毒性研究多年, 根据CNTs 体外毒理研究的国内外现状, 认为进一步研究中有若干问题值得关注.3.1 化学修饰和真实暴露尽管用原形的CNTs 进行细胞毒性检测已有报 道[28], 然而, 由于原形CNTs 的凝聚和结团, 实验中所测得的结果也变成微米颗粒物的生物效应而不是纳米材料的生物效应. 因此在CNTs 体外细胞毒性实验中, 常常通过各种化学方法进行处理使其变短并改善其水溶性, 以适合于体外实验研究. 但是, 修饰了的CNTs 所检测的细胞毒性反映的是CNTs 表面物理化学性质以及功能基团生物活性两者总体的生物效应, 而我们最终要评估的是实际生产中大量使用的原形CNTs 对人类健康和环境的影响. 因此修饰后的CNTs 能在多大程度上反应原形CNTs 的生物效应和毒性, 仍然值得探讨.使用回流和超声技术得到的CNTs 具有良好的分散性. 它们在纯水中可以长期保持稳定, 但是在细胞培养液中, 由于大量电解质的存在, 导致CNTs 较易发生凝聚而沉淀. 有研究人员用葡糖氨、苯磺酸、牛磺酸和多肽等进行化学修饰以得到水溶性更好的 CNTs. 如上所述, 实验表明这一类水溶性很好的中国科学 B 辑: 化学 2008年 第38卷 第8期681CNTs 基本无毒. 这些研究中所制备的CNTs 对药物靶向输运系统的研制和开发具有重要意义, 但对 CNTs 的安全性评估的真实价值十分有限. 因此, 过度的化学修饰不应该成为CNTs 体外安全性检测所追求的目标. 科学家要做的是尽可能采用符合实际的真实暴露, 只有这样才能更正确揭示原形CNTs 固有的生物效应和细胞毒性. 然而, 要同时满足体外毒性检测可操作性和暴露真实性是一个两难的问题, 这也是对纳米毒理学研究的严峻挑战. 因此, 规范CNTs 化学修饰策略, 开展修饰过的纳米管与原形CNTs 毒性的比对研究, 是今后CNTs 毒理学研究迫切需要解决的问题.3.2 CNTs 更完整的表征和表征的定量化鉴于体外毒理学研究结果的混乱和矛盾, 为了试图能够得到一致的, 至少是可以相互比较的实验结果, 在还没有充分了解CNTs 生物效应和毒性机制的情况下, 科学家只能呼吁在进行CNTs 体外安全性研究之前必须对纳米管进行全面详细的表征[6], 其目的是通过CNTs 严格的质量控制来尽可能保证对CNTs 细胞毒性检测的一致性. 但是, 目前对CNTs 详尽的处理和表征资料重要性的理解还不完善. Cui 等[30]完成了一个很全面的SWNTs 细胞毒性的研究, 指出SWNTs 诱导人胚肾细胞HEK293凋亡和降低细胞黏附能力. 他们在实验中检测了指示细胞功能的各项指标, 还利用生物芯片技术对SWNTs 引起的细胞基因表达的变化进行了监测, 得到了一系列详尽的结果, 包括细胞增殖和黏附能力以剂量和时间依赖方式下降, 涉及凋亡的基因上调, 和细胞周期中G 1期有关的基因被下调等等. 但是, 正如Smart 等[5]指出的, 在该论文中SWNTs 的处理方法和分散程度均没有给出, 这不能不影响实验资料的可利用性. 类似的情况同样也发生在其他研究中[31].原则上CNTs 的表征应该包括与可能的生物反 应有关的全部性质, 就目前文献报道所知, 是指纯度、其他碳成分(无定型碳, 石墨等)及含量、金属氧化物(Fe, Co, Ni)的种类和含量、CNTs 的尺度、长径比和比表面积等[6]. 我们认为表征的内容还必须进一步扩大, 深化和定量化. CNTs 生物活性的物质基础是纳米管与细胞相互作用全过程中的物理学和化学. 因此, CNTs 特性的表征应该扩展到CNTs 表面的全部物理学和化学性质. 其中CNTs 表面功能化修饰, 连接的化学功能基团的种类和数量起着尤为重要的 作用.我们课题组曾用葡糖氨嫁接到MWNTs 上, 得到了水溶性良好的MWNTs. 当用γ射线辐照MWNTs 后再化学修饰时发现, 连接在纳米管壁上的葡糖氨基团的数量随着辐照剂量的增加而增加, 这是因为γ射线在纳米管管壁造成损伤和缺陷, 增加了可修饰的碳原子密度[32]. 实验进一步指出, 随着MWNTs 上葡糖氨基团的数量增加, MWNTs 的水溶性增加, 它们对单细胞原生动物梨形四膜虫的生物效应(生长刺激作用)明显增强. 由此可见γ射线辐照技术通过增加缺陷提高了修饰在纳米管上功能基团浓度, 从而导致生物效应的放大[33]. 类似地, Sayes 等[34]通过改变化学修饰时反应物的用量, 得到了嫁接不同浓度苯磺酸或苯磺酸钠基团的SWNTs, 进一步的研究发现随着SWNTs 管壁上修饰的基团浓度的增加, 其对人皮肤纤维细胞的毒性降低. 由此可见, 要得到相一致的实验结果, CNTs 功能化的表征不仅应该反映在性质上, 而且应该体现在数量上.在CNTs 细胞毒性检测前的化学处理中, 强酸回流和超声处理不仅使CNTs 得到纯化和切割, 同时也产生结构上的缺陷, 而修饰过程中的羟基和羧基就是连接在有缺陷的管壁上. CNTs 上这些基团的浓度, 一方面依赖于CNTs 合成时在最外层碳管上形成的缺陷, 但同时也取决于化学修饰的条件, 特别是超声强度和超声时间. 可以推测, CNTs 上功能基团浓度随着超声强度的增强和超声时间的延长而增加, 其结果必然导致CNTs 水溶性的增加, 最后会影响到CNTs 的生物活性或毒性. 实验中强酸和超声处理条件对CNTs 的功能化非常关键, 然而在文字上对超声条件的具体表述有一定难度, 这可能也是CNTs 细胞毒理数据不相一致的原因之一. 因此, 我们提议, CNTs 的表征还应该包括CNTs 预处理后连接在CNTs 上功能化基团的种类及浓度, 功能化以后CNTs 的亲/疏水性, 同时实验应该注重给出化学功能化具体的实验条件. 与此有关的表征技术可以用热重分析诸颖等: 碳纳米管的细胞毒性682(TGA)、元素分析、光电子能谱分析和拉曼光谱等方法, 亲/疏水性则可以尝试测定CNTs 的油/水分配系数来表征.3.3 加强毒理机制研究CNTs 细胞毒性研究结果存在种种矛盾, 引起毒理学家和其他科研工作者的极大困惑, 其重要原因之一是目前人们对相互作用的机制还了解甚少, 因而必须加强CNTs 细胞毒性的机制研究. 纳米材料的生物效应及其机制研究是一门交叉学科, 涉及到物理学、化学和生物学等众多学科领域. CNTs 的细胞毒性机制按进展历程可分为两个阶段. 第一阶段是物理和化学过程：CNTs 首先是与培养液中无机和有机分子相互作用, 接着是内化的CNTs 与细胞内微环境中的某些成分相互作用, 两种作用都是快过程, 其结果形成纳米管复合物. 第二阶段主要是进行得较慢的生物学过程：CNTs 或/和纳米管复合物与细胞膜, 细胞器和细胞核相互作用, 从而在不同时相产生各种生物效应. 从现在发表的研究论文看, 为数不多的一些毒理学机制研究仅限于第二阶段的生物学过程, 例如相互作用的自由基过程[16]和基因调控机制[30]等. 与此相反, 第一阶段中的物理化学机制很少被关注. 众所周知, 纳米颗粒的小尺寸特点, 使它们具有一系列奇异性质, 如量子效应、隧道效应、催化效应等. 可能是由于小尺寸效应, CNTs 能大量地、而且很快地被细胞摄取; CNTs 的巨大的比表面和由此带来的高吸附能力使得CNTs 能够通过吸附作用大量结合细胞培养环境中某些重要成分, 形成纳米管复合物. 这两种效应的合并, 使得通常很难穿越细胞膜发挥其生物效应的小分子或生物大分子很容易地随CNTs 进入细胞内, 从而高效地表达其生物活性. 这很可能就是纳米毒理学重要的物理化学基础. 我们在研究中发现MWNTs 在四膜虫培养液中能够很快和蛋白胨形成纳米管-蛋白胨复合物[35], 实验进一步证明四膜虫大量摄取该复合物获得过量的蛋白胨是导致细胞生长刺激的根本原因. 该研究结果揭示了生物效应的物理化学基础, 证实了CNTs 与环境介质中某些成分相互作用对纳米材料生物效应重要影响, 因而得到了高度的关注, 被遴选为研究亮点[36]. 纳米颗粒的奇异性质导致纳米生物效应和毒性的产生, 深信沿着这个研究思路走下去, 必将逐步增进对纳米毒理的真正机制的理解. 这样不仅能够解释迄今取得的关于CNTs 细胞毒理学的实验资料, 为准确评估CNTs 对人类健康的潜在风险和环境影响提供科学依据和支撑, 而且能够为降低CNTs 毒性、提高生物安全性的保障提供新的技术.4 展望纳米毒理学是毒理学中新近迅速发展的一个分支. 作为毒理学的共性, 纳米毒理学研究当然具有毒理学研究的一般特征; 更重要的, 纳米毒理学之所以能够形成和发展是因为纳米毒理学具有自己鲜明独特的“纳米个性”. 纳米毒理学应该在研究思路、检测方法、技术路线和评估标准等方面有不同于常规毒理学的特征. 学科或门类的区分就是基于它所研究内容、方法等的特殊性, 否则纳米毒理学这个分支学科也就没有存在的必要. 然而, 在目前许多研究中, 研究者常常把纳米颗粒作为一种纳米尺度的化学物质, 把纳米毒理研究简单等同于一种化合物的常规毒理学研究, 或者再加上毒理随纳米尺度依赖关系的研究. 这种研究模式虽然在纳米毒理研究早期是必然的, 也起了一定作用, 但是它远远不能解释迄今实验发现的众多结果. 因此, 纳米毒理学的研究还属于起步阶段, 它的发展和成熟还任重而道远. CNTs 是典型的一维纳米材料, 迄今, 人们已经发现了CNTs 的许多有趣的性质, 然而新的奇异性质的研究仍在探索之中. 类似地, CNTs 毒性评估, 生物效应及其机制的研究更需要进一步的深入和系统化. 上面我们指出了CNTs 巨大的比表面具有很强的吸附能 力. 一般地, 非共价的吸附作用没有特异选择性, 因此, 常常称之为非特异性吸附. 然而, 基于CNTs 的特异结构, 这种非共价结合可能表现出某种选择性. 如果这个预测能够被证实, 将为碳纳米材料的细胞毒性研究提出更多的新课题. 因此, 我们必须科学地把握各种纳米材料的特殊性, 加强物理、化学和生命科学之间的协作, 把纳米毒理学的研究推向前进, 为纳米科技在国民经济各个领域的应用作出保驾护航的应有贡献.。