重组质粒的构建转化筛选和鉴定 (2)分解

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hin d Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hin d Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字酶切连接转化重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coli DH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类：Ⅰ类酶的识别部位和切点不同，切断部位不定；Ⅲ类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；Ⅱ类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是Ⅱ类酶。酶切又分为单酶切和双酶切，单酶切就是只用一个限制性内切酶去切质粒,使环状的质粒被切割为一条或多条线状DNA,单酶切操作简单，但是后期筛选工作复杂；双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。本实验所选用的限制酶是Hin d Ⅲ，选用方法是单酶切法。

DNA连接反应是利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子的反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。本实验所选用的连接酶是T4连接酶。

转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA 而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。为了检验连接产勿，需要对转化子进行筛选，本实验将重组质粒导入大肠杆菌，用氨苄抗性的选择培养基对转化子进行筛选；通过红白斑反应对重组子进行筛选。

电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大

分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA 片段。

为了进一步验证重组质粒的类型，本实验进行了如下后续实验：菌落PCR、进一步的酶切反应、和一系列的DNA电泳（对菌落PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳、重组质粒的1%琼脂糖凝胶电泳、酶切重组质粒的1.2%琼脂糖凝胶电泳），最终从电泳图中确定出酶切产物的片段大小。

正文

1.材料和方法

1.1 材料和试剂

实验材料：PUC19质粒，E.coli DH5α。

实验试剂：Hin d Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶，琼脂糖，TEA，质粒提取试剂盒，buffer，PCR引物，ddH2O，CaCl

，麦康凯培养基，LB液体

2

培养基等。

1.2实验方法

1.限制性核酸内切酶的酶切反应

（1）分别在1.5ml离心管中按照表1表酶切反应体系按顺序加入各组分，每组都需要酶切自己组提出的pUC19质粒，韩霜酶切λ DNA（商品），王帅酶切pUC19（商品）。

表1 酶切反应体系

（3）在37℃水浴1~2h后,将溶液存放在-20℃以待下次电泳使用。

2.第一次材料准备

（1）每组将1.5mL离心管若干放入500mL三角瓶中灭菌；

（2）全班用100 mL三角瓶装2瓶20mL无菌水以待高压灭菌

（3）全班配置用2个量筒（以及搪瓷杯）配置LB液体培养基共2000ml ，并进行如下分装：25ml/100ml三角瓶×20瓶，50ml/300ml三角瓶×6瓶,100ml/300ml 三角瓶×12瓶(加入1.3%的琼脂，即15.6g琼脂),放入高压锅灭菌。

（4）把使用的枪尖盒装满、包好，做好“黄蓝”标记，高压除菌；

3.对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳

（1）正确组装制胶槽、制胶板、18尺的样品梳（制两块胶）；

（2）取80mL1×TAE至250mL红盖试剂瓶中；再称0.8g琼脂糖，倒入瓶中，轻旋混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒；

（3）待溶液冷却至60℃左右，加入40μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/mL，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。

（4）每组取1个1.5mL离心管，加入8μL反应体系Ⅰ的酶切反应液和2μL 6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。韩霜取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅱ的λDNA（商品）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。王帅取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅲ的pUC19（商品）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。老师取1个1.5mL离心管，分别加入4μL 反应体系Ⅲ的pUC19（商品test）酶切反应液和1μL6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。

（5）待胶冷却完毕，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE 电泳缓冲液）将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm；

（6）将上述混合好的DNA样品，按照表顺序，点样到上样孔中（1~3韩霜点样；2~6王帅点样，其他上样孔各组点各自的样）。

（7）开启电泳仪电源，选择合适的电压120V和时间40min；

（8）将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连；