基因结构与表达分析的基本策略.ppt
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•竞争性杂交显示 •基因表达量差异
53 104
基因表达谱芯片研究应用思路
生物学问题提出，表达基因分析， 样本分类与实验预测
.实验设计 基因芯片实验 图象分析 结果标准化
54 105
某些基因表达异常或存在差异 生物学确证和解释分析
6
3.基因表达（gene expression）：
从DNA到蛋白质，通过转录 和翻译，用基因的遗传信息在 细胞内合成有功能意义的各种 蛋白质。
7
4.基因结构与表达分析技术：
DNA RNA
DNA序列分析※ Southern blot ※ FISH
Northern blot ※ Real -time RT –PCR ※ 基因芯片
掺入ddNTP
末端终止部位
DNA单链模板
17
2. 测序主要步骤
● 单链DNA模板的制备
● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应
● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
18
测序步骤
19
20
G反G应反管应管
A反应管
T反应管
C反应管 21
GATC
22
（二）化学裂解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
23
1.化学裂解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行 同位素标记，标记的DNA片段分成四 个反应，分别用不同的化学试剂处 理，造成碱基特异性切割，使DNA片 段分别于某一种碱基处断裂。
24
化学降解G反应模式图
样品荧光标记 芯片制备 芯片杂交 芯片洗涤和扫描 扫描图像分析
51 102
核酸杂交技术和微阵列芯片
标记
克隆
杂交、显影
高密度
阵列()
微阵列( )
52 103
基因表达谱芯片的原理
二种样品竞争性杂交示意图
样品1 样品2
A B C
A B C
提取
A
A
B
B
C
C
5-标记
A
A
B
B
C
C
3-标记
53荧光标记
A B C
37
应用举例
Nt
28S
3638 2604
18S
623
琼脂糖凝胶电泳
3kb 0.4 kb
38
0d 2d 4d 6d 8d 靶
GAPDH
杂交分析的表达
39
wenku.baidu.com
三、其他杂交技术
(一)斑点杂交 ( ）:
将或变性后直接点 样于硝酸纤维素膜或尼 龙膜上，用于基因组中 特定基因及其表达的定 性及定量研究。
●● ● ● ●●
28
2. 自动测序结果
29
(Ⅱ)核酸分子杂交
30
核酸分子杂交技术的建立
● 细胞原位杂交 （ ， 1969) ● 印迹杂交※: 检测 （ ，1975） ● 印迹杂交※: 检测 （ ，1977）
31
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链或局部互补结合形成杂交双链。
应用：核酸靶或序列的定性与定 量分析。
● 高分辨率变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术
● PAGE能分离长度为300500个碱基,差别仅1个碱基的单 链寡核苷酸DNA片段。
11
共同分享化学奖(1979)
(, ＆, )
12
(一）双脱氧链末端终止法 （）
以合成 反应为基础。
蛋白质
Western blot※ 蛋白质芯片
8
讲授内容：
(Ⅰ)序列分析※ (Ⅱ)核酸分子杂交※
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
(Ⅳ) 免疫印迹※
(Ⅴ) 聚合酶链式反应※
9
一、序列分析
（一）双脱氧链末端终止法※ ( ,1977)
（二）化学裂解法 ( ＆ ,1977 )
（三）自动化序列分析
10
测序技术基础：
47
● 基因芯片上的阵列是由有规则排列的或寡核苷酸等样本 所组成的 。
● 基因表达高通量分析法。
48
微阵列： ● 微阵列（ ） ● 寡核苷酸微阵列（）
49
微阵列: 在一微小的基片（硅片等）
表面集成了大量分子识别探针， 能够平行分析大量基因转录表 达，因此又被称为芯片。
50
基因表达谱芯片主要技术流程：
章
基因结构与表达分析的基本策略
1
概论
1. 双螺旋结构发现 （ ＆,1953）
1962
2
A. öm
. ,. , , ,
.
.
,
.
3
2.中心法则提出（，1958）
,1916-2004
Central Dogma 4
反转录机制阐明（ 1970 ）
补充的中心法则
5
中心法则： 代表了大多数 生物遗传信息贮存和表达 的规律，奠定了从分子水 平研究生命科学关键问题 的理论基础。
32
33
一、印迹杂交 ()
将电泳分离的待测片段结合 到一定的固相支持物上，然后与 存在于液相中标记的核酸探针进 行杂交的过程。
34
Southern Blotting
Paper Towels
1 35
Agarose Gel Electrophoresis
_
+
3
36
二、印迹杂交 ()
指将变性及电泳分离后，并 转移到固相支持物上，用杂交反 应来鉴定其中特定分子的含量及 其大小。
42
2．酶保护分析法 （ ，）
43
基本程序：
●待测的分离 ●体外转录标记探针 ●待测与探针进行液相杂交 ● 酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
44
3.抑制消减杂交原理 （ ，）
以杂交为基础，并与技术结 合的消减杂交方法。
应用：差异表达新基因的筛选与克隆。
45
原理
46
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
硫酸二甲酯
哌啶
25
（三）测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标
记4种终止反应产物，替代放 射性同位素标记是实现测序自 动化的基础。
26
1. 自动测序步骤：
4种带有不同荧光染料标 记的终止物
测序反应
反应产物毛细管电泳分离
27
激光激发不同大小片段上的 荧光分子，发射出四种不同 波长的荧光
荧光信号采集、计算机 分析与自动排序。
40
（二）原位杂交 （）
用标记的核酸探针与组织切 片或细胞中的待测核酸互补序列 杂交，可对核酸进行定性、定位 和相对定量分析。
41
（三）液相杂交 ()
1．核酸酶S1 保护分析法 ( S1 ） 单链探针与待测形成杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解 未形成杂交体的或单链，杂交双链则受到保护而不被降解。
()
13
、和的结构
ATP
dATP ddATP
14
DNA合成反应
掺入N个核苷酸
掺入N+1个核苷酸
15
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存 在3′-OH末端，故不能与下一个 核苷酸的5′-P端形成3′，5′磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸 提前终止于ddNTP 。
16
引物 延伸的新合成链
53 104
基因表达谱芯片研究应用思路
生物学问题提出，表达基因分析， 样本分类与实验预测
.实验设计 基因芯片实验 图象分析 结果标准化
54 105
某些基因表达异常或存在差异 生物学确证和解释分析
6
3.基因表达（gene expression）：
从DNA到蛋白质，通过转录 和翻译，用基因的遗传信息在 细胞内合成有功能意义的各种 蛋白质。
7
4.基因结构与表达分析技术：
DNA RNA
DNA序列分析※ Southern blot ※ FISH
Northern blot ※ Real -time RT –PCR ※ 基因芯片
掺入ddNTP
末端终止部位
DNA单链模板
17
2. 测序主要步骤
● 单链DNA模板的制备
● DNA模板与测序引物退火 ● 掺入法标记反应 ● 延伸-终止反应
● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 放射自显影 ● 阅读测序结果
18
测序步骤
19
20
G反G应反管应管
A反应管
T反应管
C反应管 21
GATC
22
（二）化学裂解法
与末端终止法不同，化学 降解法是建立在对原有DNA的 化学降解过程基础上。
23
1.化学裂解法原理
将待测DNA片段3′或5′端进行 同位素标记，标记的DNA片段分成四 个反应，分别用不同的化学试剂处 理，造成碱基特异性切割，使DNA片 段分别于某一种碱基处断裂。
24
化学降解G反应模式图
样品荧光标记 芯片制备 芯片杂交 芯片洗涤和扫描 扫描图像分析
51 102
核酸杂交技术和微阵列芯片
标记
克隆
杂交、显影
高密度
阵列()
微阵列( )
52 103
基因表达谱芯片的原理
二种样品竞争性杂交示意图
样品1 样品2
A B C
A B C
提取
A
A
B
B
C
C
5-标记
A
A
B
B
C
C
3-标记
53荧光标记
A B C
37
应用举例
Nt
28S
3638 2604
18S
623
琼脂糖凝胶电泳
3kb 0.4 kb
38
0d 2d 4d 6d 8d 靶
GAPDH
杂交分析的表达
39
wenku.baidu.com
三、其他杂交技术
(一)斑点杂交 ( ）:
将或变性后直接点 样于硝酸纤维素膜或尼 龙膜上，用于基因组中 特定基因及其表达的定 性及定量研究。
●● ● ● ●●
28
2. 自动测序结果
29
(Ⅱ)核酸分子杂交
30
核酸分子杂交技术的建立
● 细胞原位杂交 （ ， 1969) ● 印迹杂交※: 检测 （ ，1975） ● 印迹杂交※: 检测 （ ，1977）
31
核酸分子杂交原理
标记的单链核酸探针与待检测的 靶单链或局部互补结合形成杂交双链。
应用：核酸靶或序列的定性与定 量分析。
● 高分辨率变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术
● PAGE能分离长度为300500个碱基,差别仅1个碱基的单 链寡核苷酸DNA片段。
11
共同分享化学奖(1979)
(, ＆, )
12
(一）双脱氧链末端终止法 （）
以合成 反应为基础。
蛋白质
Western blot※ 蛋白质芯片
8
讲授内容：
(Ⅰ)序列分析※ (Ⅱ)核酸分子杂交※
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
(Ⅳ) 免疫印迹※
(Ⅴ) 聚合酶链式反应※
9
一、序列分析
（一）双脱氧链末端终止法※ ( ,1977)
（二）化学裂解法 ( ＆ ,1977 )
（三）自动化序列分析
10
测序技术基础：
47
● 基因芯片上的阵列是由有规则排列的或寡核苷酸等样本 所组成的 。
● 基因表达高通量分析法。
48
微阵列： ● 微阵列（ ） ● 寡核苷酸微阵列（）
49
微阵列: 在一微小的基片（硅片等）
表面集成了大量分子识别探针， 能够平行分析大量基因转录表 达，因此又被称为芯片。
50
基因表达谱芯片主要技术流程：
章
基因结构与表达分析的基本策略
1
概论
1. 双螺旋结构发现 （ ＆,1953）
1962
2
A. öm
. ,. , , ,
.
.
,
.
3
2.中心法则提出（，1958）
,1916-2004
Central Dogma 4
反转录机制阐明（ 1970 ）
补充的中心法则
5
中心法则： 代表了大多数 生物遗传信息贮存和表达 的规律，奠定了从分子水 平研究生命科学关键问题 的理论基础。
32
33
一、印迹杂交 ()
将电泳分离的待测片段结合 到一定的固相支持物上，然后与 存在于液相中标记的核酸探针进 行杂交的过程。
34
Southern Blotting
Paper Towels
1 35
Agarose Gel Electrophoresis
_
+
3
36
二、印迹杂交 ()
指将变性及电泳分离后，并 转移到固相支持物上，用杂交反 应来鉴定其中特定分子的含量及 其大小。
42
2．酶保护分析法 （ ，）
43
基本程序：
●待测的分离 ●体外转录标记探针 ●待测与探针进行液相杂交 ● 酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
44
3.抑制消减杂交原理 （ ，）
以杂交为基础，并与技术结 合的消减杂交方法。
应用：差异表达新基因的筛选与克隆。
45
原理
46
(Ⅲ) 基因芯片和微阵列
硫酸二甲酯
哌啶
25
（三）测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标
记4种终止反应产物，替代放 射性同位素标记是实现测序自 动化的基础。
26
1. 自动测序步骤：
4种带有不同荧光染料标 记的终止物
测序反应
反应产物毛细管电泳分离
27
激光激发不同大小片段上的 荧光分子，发射出四种不同 波长的荧光
荧光信号采集、计算机 分析与自动排序。
40
（二）原位杂交 （）
用标记的核酸探针与组织切 片或细胞中的待测核酸互补序列 杂交，可对核酸进行定性、定位 和相对定量分析。
41
（三）液相杂交 ()
1．核酸酶S1 保护分析法 ( S1 ） 单链探针与待测形成杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解 未形成杂交体的或单链，杂交双链则受到保护而不被降解。
()
13
、和的结构
ATP
dATP ddATP
14
DNA合成反应
掺入N个核苷酸
掺入N+1个核苷酸
15
1. 双脱氧末端终止法原理
DNA合成反应中，ddNTP不存 在3′-OH末端，故不能与下一个 核苷酸的5′-P端形成3′，5′磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸 提前终止于ddNTP 。
16
引物 延伸的新合成链