植物组织培养实验中相关的问题答案

1.为什么顶端分生组织没有病毒，生长的好？病毒在寄生植物体内随维管束系统转移，在茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动困难，其移动速度落后于茎尖生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，甚至不带病毒。

、①在植物体内，病毒是通过维管束系统移动的，分生组织不存在维管束系统。

②病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝移动，速度较慢，难以赶上茎尖分裂旺盛的分生细胞。

③分裂旺盛的分生细胞代谢活性强，使病毒无法复制。

2.超净工作台的工作原理？将室内空气经粗过滤器初滤,由离心风机压入静压箱,再经过高效空气过滤器精滤,由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌区,从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。

将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于０．３μｍ的尘埃、真菌和细菌孢子等等。

超净空气的流速为２４～３０ｍ／ｍｉｎ，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。

3.植物组织培养中培养液中的碳源为什么蔗糖最好，为何不用单糖？螯合铁有何好处？植物在光合作用后合成的碳水化合物一般以蔗糖和淀粉形式储存，蔗糖可以储存也方便转运，且植物利用蔗糖的系统很完善，因此培养基用蔗糖。

培养基中添加蔗糖而不是葡萄糖，是以大量实验为基础的。

大量实验表明，蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，因此被作为植物组织培养的标准碳源而广泛应用，大多数合成培养基也均以蔗糖作为唯一的碳源。

其中的原因可能有下列几个方面：①同样作为碳源和能源物质，蔗糖较葡萄糖能更好地维持培养基内的低渗环境。

配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。

同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。

②植物组织培养过程中，要特别注意防止培养基受到微生物的污染。

微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖，而较少利用蔗糖，因此采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少微生物的污染。

③从能源供应来说，相同物质的量浓度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。

使用螯合铁的目的：避免沉淀；缓慢不断地供应铁。

4.培养基为什么不能太软？培养基太软，材料在培养基中不稳定，甚至下沉，从而影响组织的呼吸。

培养基的硬度可能受到所用琼脂的质量、培养基pH 及无机盐浓度的影响，灭菌时间过长也回导致培养太软。

5.至少5种灭菌剂的灭菌原理？1.氯化汞氯化汞也称升汞，是一种剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌的原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性，酶失活。

氯化汞使用浓度为0.1%～0.2%，浸泡8～15分钟，就可以有效地杀死附着在外植体表面的细菌及真菌芽孢，灭菌效果极好。

但用氯化汞灭过菌的外植体材料要用无菌水反复多次洗涤（一般不少于5次），才可将残留的药剂除净。

使用氯化汞会给环境造成污染，一般情况下，应尽量用其它消毒剂灭菌，而以少用或不用氯化汞为宜。

2.次氯酸钠市售次氯酸钠又称为“安替福民”，活性氧含量是0.8%，使用时稀释3～5倍，浸泡外植体5～30分钟后，再用无菌水洗涤4～5次。

它分解出具有杀菌作用的氯气，灭菌后易于除去，不留残余，杀菌力强，对植物材料无害，是植物组织培养常用的杀菌剂之一。

3．漂白粉漂白粉为白色的粉末，一般含10%～20%（质量／体积）的次氯酸钙[Ca(ClO2)]，使用时用饱和溶液，杀菌的原理在于它分解出具有杀菌作用的氯气。

氯与蛋白质中的氨结合，使菌体蛋白质氧化，代谢功能发生障碍。

注意漂白粉腐蚀金属、棉织品，刺激皮肤，易吸潮散失有效氯而失效，平时要密封储藏，最好现配现用，不要储藏太久。

4.酒精酒精（乙醇）具有较强的穿透力和杀菌力，它使细菌蛋白质变性。

使用的浓度一般为70%～75%。

处理时间15～30秒，不宜太长，因为细胞容易收缩脱水。

它具有浸润和灭菌的双重作用，使用于表面消毒，但不能达到彻底的灭菌，必须结合其它药剂灭菌。

为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，以改变细胞表面带电荷的性质而增加膜透性，提高乙醇的灭菌效果。

5.高锰酸钾高锰酸钾的灭菌原理在于它能使细菌酶蛋白中的巯基氧化成二硫基而失去酶活性。

浓度稀时起氧化作用杀死细菌，日常生活中通常用作皮肤、果蔬的表面消毒剂，在一盆清水中加入几粒高锰酸钾就可起到杀菌的作用。

6.植物组织培养中脱除病毒的方法及其优缺点。

热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织，进行无毒个体培育。

常用的方法是将病毒感染的植物用35℃～38℃热空气处理2～4周或者更长时间进行脱毒。

此法尤其适合处理生理干旱的材料和处于休眠状态的果树。

热处理法中，最主要的影响因素是温度和时间。

Bhardwaj等发现在热空气处理过程中，通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好，但是同时植物的生存率却呈下降趋势。

所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性两个方面。

洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用两种处理，一为恒温处理，温度控制在37±1℃；二为变温处理，温度为32℃和38℃每隔8h变换一次，发现变温处理比恒温处理植株死亡率低，脱毒效率高。

该项技术要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。

主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全，例如TMV这类杆状病毒就不能用这种方法脱除，因而该方法有一定的局限性。

茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。

茎尖培养中最主要的影响因素就是茎尖大小，一般要求茎尖长度小于1mm。

技术上通常切取茎尖越小，脱毒效果越好，但是茎尖培养成活率变低。

茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。

为了克服这一缺点，现在经常是将热处理与茎尖培养相结合来使用。

热处理与茎尖培养相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（在1mm左右），从而能够提高培养或嫁接的成活率。

董雅凤等在梨树苹果茎沟病毒的脱毒技术研究中发现，梨茎尖培养比较困难，且脱毒效果差，成活率仅为28%。

热处理后进行茎尖培养，成活率和脱毒率比单纯茎尖培养平均增加11.7%和54.3%。

抗病毒药剂法是一种新的脱毒方法，其作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成。

常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑），5-二氢尿嘧啶（DHT）和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。

这些药物常常通过直接注射到带病毒的植株上，或者加到植株生长的培养基上。

这种方法一般要与茎尖培养相结合应用。

经过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。

采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法，可以较容易的脱除多种病毒，而且这种方法对取材要求不严，接种茎尖可大于1mm，易于分化出苗，提高存活率。

有些病毒比较难去除，单独使用其中某一个方法很难获得成功，所以有人将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合使用，效果更好。

7.无病毒株系的检测方法及其原理。

1.指示植物法当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，这是因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。

具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上，对于木本植物，是将原始寄主嫁接到指示植物上。

指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类。

2.酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA是一种免疫酶技术，它是本世纪70年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定技术，是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。

酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，来检测病毒的存在。

ELISA方法依据支持物的不同，可分为双抗体夹心法（DAS）-ELISA和硝酸纤维素膜（NCM）-ELISA。

（1）DAS-ELISA 这种方法是以聚苯乙烯塑料管或血凝滴定板为支持物，采用直接ELISA，基本步骤是先加入第一抗体，再依次加入病毒提取液、第二抗体、底物，所以叫做双抗体夹心。

DAS-ELISA方法检测病毒，特异性强，非常适合于大规模的检测，该方法可检测出1～10ng/mL的抗原浓度，通过分光光度计可测定出病毒含量，对脱毒苗的确认极具应用价值。

（2）NCM-ELISA 又称Dot-ELISA，该种方法是以NCM为固相载体，通常采用间接ELISA，基本步骤是首先将待测样品点在NCM膜上，然后依次加入病毒第一抗体，第二抗体，底物。

此法与常规法相比有很多优点，NCM对蛋白质有较高的亲和力，提供蛋白较大的结合表面，使检测的灵敏度提高，而且反应产生鲜明的色斑，形成强烈的对比；NCM法测定所需的最低病毒量低于常规ELISA。

3. 免疫电镜法（ISEM）植物病毒免疫电镜检测是利用植物病毒特异性的抗体，使它诱捕或包被病毒的粒体，产生免疫吸附反应。

将此程序制备的载网，放到电子显微镜下观察。

此法鉴定植物脱毒苗病毒能够保证核心种苗的质量，而且快速准确，反应灵敏。

但是电镜方法的缺点是受条件限制，操作要求严格，不适于普及应用。

此外，Ig指示试纸法，病毒细菌协同凝集法(VB)，也可以用来检测病毒。

4.反转录聚合酶链反应（RT-PCR）RT-PCR的基本原理是以所需检测的病毒RNA为模板，反转录合成cDNA，从而使极微量的病毒核酸扩增上万倍，以便于分析检测。

RT-PCR 的基本步骤是：首先提取病毒RNA，根据病毒基因序列设计合成引物，反转录合成cDNA，然后进行cDNA扩增。

取出扩增产物，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

RT-PCR技术与免疫学方法相比较不需要制备抗体，而且检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点。

（1）简并引物PCR技术根据不同病毒间的同源保守序列，设计简并性引物，而使一次实验能够检测多种病毒。

（2）免疫捕捉PCR技术在进行RT-PCR扩增反应前，利用病毒专化性抗体与病毒抗原相结合的原理，将目标病毒固定在微管或微板等固相上，经洗脱处理后富集病毒，再进行RT—PCR反应这样不仅避免了常规RT-PCR的RNA样品制备的损失和破坏，而且捕捉RNA的效率达96%以上。

（3）多重PCR技术多重PCR就是在一个单一反应中扩增多个序列，能够节省时间与精力。

RT-PCR技术与免疫学方法相比较不需要制备抗体，而且检测所需的病毒量少，具有灵敏、快速、特异性强等优点，是一种比较有前途的检测方法。