实验五、多抗制备4+免疫比浊

方法评价
敏感度高，试剂稳定，因反应液 中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结 果影响也小，所以结果稳定、可靠， 特异性好；不需特殊仪器设备，一般 分光光度计、自动化生化分析仪或散 射比浊仪均可使用。
总评价
缺点：
测定结果与仪器 的性能和试剂的质量 密切相关，特别对抗 体的质量要求高，仪 器和试剂价格比较贵。
3. 4.
(三) 双向免疫扩散试验的应用
1. 检测未知抗原或抗体及其相对含量
将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中 ① ② ③ 根据沉淀线有无定性； 根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量 根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。
沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系
A：Ag、Ab浓度及扩散率近似； B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞ Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜ Ab ； D：扩散率近似，浓度Ag ＞ Ab ； E：浓度Ag ＞ Ab，扩散率Ag ＞ Ab ； F：浓度Ag ＜ Ab，扩散率Ag ＜ Ab
免疫浊度测定
（一）基本原理：
免疫浊度测定的基本原理是：抗原 抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体 复合物，使反应液出现浊度。当反应液 中保持抗体过量且固定时，形成的复合 物随抗原量增加而增加，反应液的浊度 亦随之增加，与一系列的标准品对照， 即可计算出受检物的含量。
（二）类型 1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
2. 抗原性质分析
利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原
加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根
据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。
三种扩散基本图型
3. 抗体效价滴定
用梅花型孔，中间放 抗原，周围孔放下不 同稀释度的相应抗体， 以出现沉淀线的最高 稀释倍数为该抗体的 效价。
1 2 3
6 5 4
中间孔—抗原； 周围孔——血清
(四) 影响因素
1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗 原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求 待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性， 否则可能出现结果偏高或偏低。 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔 抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为 1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验 敏感度，应首选敏感度高的抗血清。
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳 颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时， 则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长 之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时， 则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳 凝集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
4. 抗体或抗原纯度鉴定
• 用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出 现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯， 出现多条说明不纯。
双扩散试验优缺点
• 优点：简单易行，用途广泛
• 缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不 能精确定量。
经典的沉淀试验有4个缺点无法克服： ① 操作繁琐 ② 敏感度低（10～100μg/ml） ③ 时间长 ④ 难以自动化
本次实验内容
• 实验一、双向免疫扩散试验 ——LDL多抗鉴定及效价测定 • 实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验一、双向免疫扩散试验 ——LDL多抗鉴定及效价测定
• 血清的采集与处理
• 取血方法：
血清的采集：耳缘静脉取血或颈动脉取血。
• 血清处理：
取好血后，放入37℃，30min后，使血清充分 析出（不能冰冻，否则产生溶血），经 3000rpm/5min分离血清，剩余放进-20℃冰 箱保存。
沉淀反应
微生物与免疫教研室
本次实验内容
• 实验一、双向免疫扩散试验 ——LDL多抗鉴定及效价测定 • 实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
一、本次实验的目的：
1、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用 方法。 2、掌握双向免疫扩散试验方法。 3、掌握抗体效价的判断。 4、掌握免疫浊度的测定原理。 5、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。
①
双扩散免疫电泳
一、单向免疫扩散试验
(一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，
使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，
与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大
小与抗原浓度呈正相关。
(二) 操作步骤
（平板法）
1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻 倾注成平板。 2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已 稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准 品溶液。
③不宜用于药物等半抗 原的测定；
④灵敏度较散射比浊法 低。
2 散射免疫比浊法
原理：
散射光系指一定波长的光沿水平轴照射， 碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生 偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大 小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的 一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强 度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多， 形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为 速率散射比浊法(rate nephelometry)和终点散 射比浊法(endpoint nephelometry)。
3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低； 抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原 间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过 大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也 增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加 大稀释度以提高敏感度。
二、双向琼脂扩散试验
(一) 原理
将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶 板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四 周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比 例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀 线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩 散速率等有关。
优点：
①自动化 ②快速(30～60s) ③灵敏(μg/L) ④准确 ⑤精密度高(CV<5％) ⑥稳定性好 ⑦节省试剂 ⑧检测范围广 ⑨不需减去样本和试剂 本底值等优点。
(三)免疫比浊法主要影响因素
1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.抗原抗体反应的溶液 4.增浊剂的使用
1 抗原抗体比例
1. 高剂量钩状效应（high dose hook
3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后 可见其孔周围出现沉淀环。
单向辐射状免疫扩散
上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清， 下排右2为一异常病理血清
(三) 方法评价
单向琼脂扩散试验是一种稳定、 简便、毋需特殊设备，一般实验室 均可使用的常规方法，试验的重复 性和线性均好。敏感度为1.25mg/L
凝胶内沉淀试验
酰胺凝胶等。
★根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀
验分为2类： （一）免疫扩散
单向免疫扩散试验 (single gel diffusion test) ②双向免疫扩散试验 (double gel diffusion test) 火箭免疫电泳 （二）凝胶免疫电泳 (gel immuno-electrophoresis)
effect ) 2. 海德堡（heidelberger）曲线理论
2 抗体的质量
（1）特异性高
（2）效价高 （3）亲和力高
（4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5 • 电解质PEG、tween-20等非离子型亲水剂 • 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
特异性 比例性 可逆性 阶段性
沉淀反应的特点
• 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖
• 沉淀反应分两个阶段：
• 第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见)
• 第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）
条件 电解质，温度，酸碱度
(gel phase precipitation)
主要是指琼脂糖扩散或称凝胶
扩散(gel diffusion)。常用的凝胶 有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀
(二) 操作步骤
1. 2. （平板法） 融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。 凝固，打孔 孔径3mm，孔间距3~5mm， 孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花 孔型。 加样 在相对孔内加抗原或抗体。 孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗 原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。 沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的 纯度、浓度和扩散速度有关。
方法评价：
优点：
①
② ③ ④
缺点：
①抗体用量较大； ②检测需抗原抗体反应 达到平衡，耗时较长；
灵敏度比单扩法高5— 10倍； CV小于10％； 操作简便快速，1h可报 告结果； 结果准确，且能用全自 动化或半全自动化仪器 进行分析，尤其随着胶 乳粒子增强浊度测定法 的出现，使敏感度提高， 其应用更加广泛。
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
沉淀反应（precipitation）
可溶性抗原与相应抗体在适
当条件下发生特异性结合所出现 的沉淀现象。
分类
液体内沉淀试验
絮状沉淀试验 环状沉淀试验
免疫浊度测定 免疫扩散 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 免疫电泳 火箭免疫电泳 对流免疫电泳
沉 淀 反 应
凝胶内沉淀试验
思考：抗原抗体反应的四大特点？
血清的稀释倍数 分别为：
孔1—1/8；
孔2—1/16； 孔3—1/32； 孔4—1/64； 孔5—1/128；
效价检测结果
孔6—1/256
• 该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔 七天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。