毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册

大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许

多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶

水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构

复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级

结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋

白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大

肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原

核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折

叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题

［ 1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（ Saccharomyces.Cerevisiae ）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主． 1981 年

酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得

到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达

由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此

引起产量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养

基时，往往导致产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（ methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［2］。

甲基营养型酵母包括： Pichia 、Candida 等．以 Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）

为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表

达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该

系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、 2、 3］；

⑴具有醇氧化酶 AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。

⑵ 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。（即同源重组）

⑶ 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。

⑷ 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。

Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基

因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物

有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了 HBsAg、TNF、 EGF、破伤风毒素C 片段、基因工程抗体等多种外源基因，

证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征

的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon 制剂已获得 FDA批准，

所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越

来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工

程产品［ 2、 3］。

近年来， Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经

有300 多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。毕赤酵母宿主菌常用的有 GS115和 KM71两种，都具有 HIS4 营养缺陷标记。其中，

GS115茵株具有 AOX1基因，是 Mut＋，即甲醇利用正常型；而 KM71菌株的 AOX1位点被 ARG4基因插入，表型为 Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生

同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［5］．包括

启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先

在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还

需带有信号肽序列。

毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效

分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的 N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进

入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对外

源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用 pPICZαA 质粒，其信号肽来

自酿酒酵母的α - 交配因子（α-factor ），能很好的达到以上的要求。并且作为新

一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin 抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、2］。

pPICZα A质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：

⑴具有强效可调控启动子AOX1（ alcohol oxidase，醇氧化酶）；