生化分离技术复习题及答案

离心技术1、什么是离心技术？这种技术主要应用于哪些方面？离心技术是分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一种技术。

它是利用物质沉降系数、密度、浮力等方面的差别，用强大的离心力场将其分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。

离心技术既可以是制备性的也可以是分析性的。

处理的样品可多可少（几千L至0.2mL以下），应用范围十分广泛。

这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物，天然的生物大分子、无机物、有机物，在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。

2、离心机的种类有哪些？主要性能如何？根据性能，离心机分为三种类型，即低速离心机（转速在2000～6000r/min之间，最大RCF可达6000g）、高速离心机（转速在18000～25000r/min之间，最大RCF 可达60 000g）、超速离心机（转速在40 000～100 000r/min之间，最大RCF可达803 000g）。

超速离心机按性能又分为分析型、制备型和分析制备型三类。

3、超速离心机主要由哪四个部分构成？分析性离心机构造的特点是什么？超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。

分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。

从而确定其物理性质。

分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。

此转头通过一个有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上，转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转，转头上有2～6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有一个光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。

4、转子是离心机的附件，制备转子主要由哪几种？它们各适用于哪种离心方法？⑴角式转头⑵荡平式转头：这种转头最适合做密度梯度区带离心，⑶区带转头：区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。

⑷垂直转头：适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。

⑸连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离。

5、塑料离心管都配有管盖，管盖的作用如何？防止样品外泄。

用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。

防止样品挥发。

支持离心管，防止离心管变形。

6、什么是离心力和相对离心力？离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。

离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积。

相对离心力RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

7、什么是沉降速度？沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。

8、简述离心技术的基本原理。

当物体围绕某一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。

旋转速度越高，运动物体所受到的离心力就越大。

如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用与溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。

在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。

经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。

9、相对离心力列线图在实际应用中有什么意义？将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF 标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。

例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。

10、沉降系数S有哪两个重要用途？预计沉降时间；测定物质分子质量11、按照实际工作的需要，已设计出的离心方法主要有哪些？⒈平衡离心法根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法和速率区带离心法。

⒉等密度离心法又称等比重离心法，依粒子密度差进行分离，等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。

⒊经典式沉降平衡离心法用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化等。

12、离心操作的注意事项主要有哪些？1）使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

2）装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。

每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

3）若要在低于室温的温度下离心时。

转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

4）离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

5）每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。

每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。

13. 比较差速沉降离心法与区带离心法的不同？电泳技术1、哪一年，哪个国家的科学家因为什么贡献获得了1948年的诺贝尔化学奖？1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。

2、电泳技术的基本原理？电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。

许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

3、何为电泳迁移率（m）和电泳相对迁移率（Rm）？电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度相对迁移率mR就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。

4什么是电渗作用？液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。

5按分离原理电泳技术可分为哪几类？电泳按其分离的原理不同可分为：⑴区带电泳；⑵自由界面电泳；⑶等速电泳；⑷等电聚焦电泳6醋酸纤维薄膜电泳的优点有哪些？①醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。

②快速省时。

③灵敏度高，样品用量少。

④应用面广。

⑤醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。

7琼脂糖凝胶电泳主要有哪些类型？水平式板状琼脂糖凝胶电泳，垂直式琼脂糖凝胶电泳8琼脂糖凝胶电泳的优点有哪些？1）支持物透明、无紫外吸收特性，易于检测。

2）凝胶制作简单。

3）分辨率高。

4）重复性好。

5）电泳区带易于染色，易于洗脱。

9什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳？凝胶聚合的单体、交联剂是什么？聚合方法有哪两种方式？需要的加速剂和催化剂是何物？聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成。

常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。

化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），光聚合的催化剂是核黄素10聚丙烯酰胺凝电泳的优点有哪些？①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。

②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度。

③电泳时不会产生“电渗”。

④由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。

⑤透明度好，便于照相和复印。

机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。

⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。

⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。

11聚丙烯酰凝胶分离物质的依据是什么？聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据被分离物质所带电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场作用下，产生不同移动速度而分离的方法。

它具有电荷和分子筛双重作用。

12不连续系统PAGE建立了哪些不连续性？分离物质的依据是什么？孔径不连续：大孔胶——浓缩胶,小孔胶——分离胶缓冲系统不连续:电极缓冲液Tris-Gly ；制胶缓冲液Tris-HclPH不连续：电极缓冲溶液————pH8.3,浓缩胶缓冲溶液————pH6.7,分离胶缓冲溶液————pH8.9.. 分离物质的依据是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应13.SDS-PAGE分离蛋白质的原理是什么？如何测定蛋白质的分子质量？电泳样品加入强还原剂，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。

SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。

这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。

亚基大小靠凝胶分子筛效应分离。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。

测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。

14.IEF-PAGE分离蛋白质的原理是什么？等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。

等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。