成骨细胞培养问题

鄙人做成骨细胞培养检测相关指标，走了许多弯路，今将自己的总结的经验贴出，望后续战友做成骨细胞培养时少走弯路，加快实验进程，不要把过多的时间耗费在培养上！
1.成骨细胞的取材：
选取新生SD大鼠的乳鼠（有参考书上新生24h的，鄙人试过72h的乳鼠，消化下来的成骨细胞活力也是很不错的），具体取材方法不详述。

2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。

如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。

离心后去掉上清液，用PBS悬浮细胞，如果发现还有很多的骨片，将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化，第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀（如果担心胶原酶2会影响细胞的生长，可以将两次的悬液离心，去掉上清液后，用培养基重悬）
3.培养基问题：
当时选取培养基问题确实弄苦了自己，因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM，所以也用这个，但是消化下来的细胞很难成活，后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基，消化下来的细胞完全可以成活下来。

但是问题接踵而至，到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%，此时只要一换液，第二天绝对培养基混浊，没有一瓶细胞活过7天的（比如今的公司倒闭的都快），怀疑是污染问题（因为正值夏季雨天），折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用，死亡现象依然在上演。

后来联系到丁香园的一个战友，他那里用的是低糖的DMEM培养基，没有出现我的问题，
建议我换用这个！我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基，使用后细胞生长良好，繁殖旺盛！没有出现死亡漂浮现象！
个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的（相比神经细胞，肾细胞等），高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原（类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪），另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠，一换液就会漂浮，将细胞从底壁带下来。

4.培养瓶
起初偶使用的是25ml的玻璃培养瓶，这个东西简直太轻了，手指一触，它就乱动，后来改用50ml玻璃培养瓶，一只老鼠的头盖骨消化下来的细胞接种到50ml培养瓶中，7天后完全可以传代。

见有参考书上讲5只老鼠的头盖骨接种到一个培养瓶中，简直是涂炭生灵，浪费大大的！
偶用的培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS液冲洗两遍），加进细胞悬液后，适度摇晃几次，是悬液均匀铺在瓶底！这样可以避免底壁出现细胞不均匀的现象，包括传代时也要如此。

包被的培养瓶，细胞很容易贴壁，我观察的是15min后就完全贴壁。

5. 关于培养基的PH值问题
市面的上的PH试纸真的不是很准确，测多了都不相信自己的眼睛了。

鄙人利用血气分析仪器，确定了到100ml培养基加多少ml的1M的NaOH，后来发现不调PH值的培养基中细胞也活的很好，完全不是查阅到的论文一定要把PH值细胞才能活下来。

建议不调最好，调过了细胞死翘翘了，真不知道问题出在哪里！尽量不要调PH值，勾兑上血清直接使用完全可以。

还有一个问题是GIBCO的粉状培养基配制是要加碳酸氢钠的（GIBCO牌子培养基特别搞
笑，一大盒培养基里面有10小包，大盒子的外面包装上注明了加多少的碳酸氢钠，但里面的小包上面完全没有，如果你只购买了一小包，千万别忘了问试剂公司大盒子上面注明的碳酸氢钠加入的量），如果你老板有钱，那你就买液体的，省的费时配制！
5.有关污染的问题
加了双抗的培养基很少会引起细菌感染的，真菌感染就难预防了，特别是在夏季比较潮湿，真菌孢子空气里游荡的很多，一不小心飘进一个就污染，几天后就在培养瓶中变成一大团。

将50ml的培养瓶加上3ml培养基，盖子拧松放置在CO2孵箱里21天，盖子下缘长满了绿毛毛，但是培养基依然澄清！所以推论，孵箱里虾兵蟹将的真不少。

处理完培养瓶，用酒精纱布搽试瓶盖和瓶颈。

如此做下来没有出现过污染的问题！
鄙人使用的是国产的牛血清，感觉还不错，没有想象中支原体问题严重。