成骨细胞培养问题

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人成骨细胞原代培养

人成骨细胞原代培养

人成骨细胞原代培养1.人成骨细胞的分离和培养:在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨,装入无菌HANK’S液中,迅速运送至实验室,充分剥离骨膜及软组织,把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为1mm×1mm×1mm大小的碎块,将松质骨块置入含有2∼3mlPBS的EP管中,用力摇动数次,然后静止30秒,令骨块沉下,小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液,无菌PBS冲洗3次。

在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL,pH为7.2),体积比为1∶2,裂解8min,离心去上液,至骨片发白放入离心管内。

2.酶消化法:加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶,在37℃恒温箱振荡预消化20min,胎牛血清终止消化,弃去消化液,PBS清洗两遍。

再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h,1000r/min离心5min,弃上清,沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min,沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀,将细胞悬液通过200目不锈钢筛网,去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分,保留骨粒。

剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化,共3次。

然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数,制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%),接种于无菌培养皿中,在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。

48h后换液,弃去悬浮细胞,每隔2d换液1次,细胞接近融合时传代。

3.组织块法:将消化过的骨块,先用血清润湿,然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中,翻转培养瓶,小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后,放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。

每周换液1次,第3周起每周换液2次,细胞接近融合时按1∶ 2传代。

成骨细胞的鉴定实验报告

成骨细胞的鉴定实验报告

一、实验目的1. 了解成骨细胞的生物学特性。

2. 掌握成骨细胞鉴定实验的方法和步骤。

3. 学会使用显微镜观察成骨细胞。

二、实验原理成骨细胞是一种具有分化能力的细胞,能够分泌骨基质,并参与骨的形成、重塑和修复。

在实验中,通过特定的鉴定方法,可以观察成骨细胞的形态、分布和功能,从而判断其是否为成骨细胞。

三、实验材料1. 成骨细胞培养液:含有成骨细胞生长所需的各种营养成分。

2. 培养基:用于培养成骨细胞的液体培养基。

3. 离心管:用于细胞离心。

4. 移液器:用于移取细胞悬液。

5. 显微镜:用于观察成骨细胞。

6. 染色剂:如苏木精、伊红等,用于染色观察细胞形态。

7. 试剂:如磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、血清等。

四、实验方法1. 成骨细胞培养(1)将成骨细胞接种于培养瓶中,加入适量培养基。

(2)将培养瓶放入培养箱中,培养条件为37℃、5%CO2、95%空气。

(3)每隔2-3天更换一次培养基。

2. 成骨细胞鉴定(1)收集培养至一定时期的成骨细胞,离心去除培养基。

(2)用PBS洗涤细胞两次,去除残留的培养基和杂质。

(3)将细胞重悬于适量的PBS中,制成细胞悬液。

(4)取少量细胞悬液,滴加于载玻片上,用盖玻片覆盖。

(5)将载玻片放入显微镜载物台上,调整焦距,观察细胞形态。

(6)用苏木精和伊红染色剂对细胞进行染色,观察细胞核和细胞质。

(7)观察成骨细胞的形态、分布和功能,判断其是否为成骨细胞。

五、实验结果1. 成骨细胞在培养过程中,细胞呈梭形、三角形或椭圆形,细胞核位于细胞中央,细胞质丰富,有明显的细胞间质。

2. 在显微镜下观察,成骨细胞形态规则,分布均匀,细胞间质中有大量钙化物质沉积,表明细胞具有成骨功能。

3. 染色后,成骨细胞核呈蓝色,细胞质呈红色,细胞形态清晰可见。

六、实验结论通过本次实验,我们成功鉴定了成骨细胞。

在显微镜下,观察到成骨细胞呈梭形、三角形或椭圆形,细胞核位于细胞中央,细胞质丰富,有明显的细胞间质。

共培养巨噬细胞和成骨细胞的方法

共培养巨噬细胞和成骨细胞的方法

共培养巨噬细胞和成骨细胞的方法下载提示:该文档是本店铺精心编制而成的,希望大家下载后,能够帮助大家解决实际问题。

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成骨培养基配方

成骨培养基配方

成骨培养基配方一、引言如何培养和研究骨细胞和骨组织的生长及发育一直是骨科研究的重要课题。

成骨培养基是用于体外骨细胞培养和研究的培养基,它提供了营养物质和生长因子,创造了适合骨细胞或骨相关细胞生长的环境。

本文将介绍成骨培养基的配方及其主要成分。

二、成骨培养基配方的重要性成骨培养基是进行骨细胞培养和研究的重要工具。

它可以为骨细胞提供必需的营养物质、生长因子和其他必要的成分,促进骨细胞的生长和分化,同时提供一个适合生物学实验的模拟环境。

成骨培养基的配方很重要,不同的成分搭配会对骨细胞的生长和分化产生不同的影响。

三、成骨培养基的基本组成成骨培养基的基本组成通常包括以下成分:1. 基本培养基基本培养基是成骨培养基的主要组成部分,它提供了必需的细胞营养物质和生长因子。

常用的基本培养基包括Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)和Minimal Essential Medium(MEM)。

这些培养基中含有适量的葡萄糖、氨基酸、维生素和盐类,为骨细胞提供了必需的营养。

2. 补充因子补充因子是指在基本培养基中补充的一些特定的生长因子和蛋白质。

常见的补充因子有:•胰岛素生长因子(Insulin-like Growth Factor,简称IGF):IGF可以促进骨细胞的生长和分化。

•骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,简称BMP):BMP是一类重要的生长因子,可以促进骨细胞的增殖和分化。

•美洛昔康(Dexamethasone):美洛昔康是一种合成的皮质类固醇激素,可以促进骨细胞的分化和成熟。

•抗生素:在培养过程中,添加适量的抗生素可以防止细菌和真菌的污染。

3. 有机物质有机物质是成骨培养基的重要成分之一,它提供了骨细胞所需的能量和其他有机物质。

常用的有机物质有葡萄糖和胺基酸。

葡萄糖是骨细胞的主要能源来源,能够提供细胞所需的能量。

胺基酸是合成蛋白质的基本单位,也是骨细胞所需的重要营养物质。

成骨细胞的研究与应用

成骨细胞的研究与应用

成骨细胞的研究与应用成骨细胞是一种在骨头中起关键作用的细胞。

这些细胞具有许多独特的特点,例如它们能够合成骨基质和分泌骨形成生长因子。

研究人员一直在探究成骨细胞的机制和应用,以帮助改善骨质疏松症等疾病的治疗。

一、成骨细胞的生理功能成骨细胞是一种细胞,主要分布在骨组织中。

成骨细胞的主要作用是促进骨形成。

它们能够合成骨基质和骨纤维蛋白等物质,以及分泌骨形成生长因子和促进骨细胞增殖的化学物质。

此外,它们还参与骨质重塑以及破骨细胞和成骨细胞之间的平衡。

二、成骨细胞与骨质疏松症骨质疏松症是一种常见的骨代谢疾病,其特征是骨质量低下、骨密度降低、骨质组织的微结构异常、骨折等。

成骨细胞在骨质疏松症的治疗中具有重要作用。

研究发现,针对成骨细胞的药物可以帮助提高骨密度和抑制骨质疏松症的发展。

此外,研究还表明,成骨细胞的数量和功能的下降是骨质疏松症发生的一个重要原因。

三、成骨细胞与骨折愈合成骨细胞在骨折愈合中起关键作用。

在骨受到损伤后,成骨细胞会通过旁分泌的骨形成因子和生长因子等分泌物质来引导骨生长和修复。

研究人员还在探索利用成骨细胞在骨科手术、骨折愈合和骨移植等方面的应用。

四、成骨细胞在组织工程方面的应用成骨细胞在组织工程方面也具有广阔的应用前景。

组织工程是一种将生物学、医学和工程学方法相结合,利用体外培养细胞和人工材料等技术来重建人体组织的方法。

利用成骨细胞,研究人员可以在体外进行组织工程构建,制造出具有骨质结构和功能的三维复合结构,该技术可以应用于骨再生和骨移植等方面。

总之,成骨细胞在骨组织中具有非常重要的作用,其机制与功能的研究和应用可以帮助我们更好地理解骨生长和疾病的发生发展。

未来,我们相信,随着对成骨细胞的深入研究,我们会创造出更多的医学应用和发展前景。

成骨细胞与破骨细胞的共培养体系

成骨细胞与破骨细胞的共培养体系

成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
1 建立成骨细胞与破骨细胞共培养体系
成骨细胞和破骨细胞是骨再生的重要细胞,在成骨和破骨之间存
在矛盾性相互作用,为解决该矛盾性作用,建立成骨细胞与破骨细胞
共培养体系是有必要的。

1.1 获取细胞
获取成骨细胞和破骨细胞是共培养体系的第一步。

一般的获取方
式有从动物原位骨组织采集、从动物移植位骨组织采集以及从动物分
化出的骨细胞培养采集等;此外,还可以利用旁路移植操作获得成骨
和破骨细胞,以及通过多剂量胶原纤维骨再生制备法获取到成骨细胞,以及经过分离纯化的单个样品。

1.2 制备培养基
共培养体系建立的必要组成部分之一是,必须将对成骨细胞和破
骨细胞培养基进行优化;即构建一个基于实验的的多层联合的培养体系。

1.3 实现活细胞共培养
实现活细胞共培养仅用AMP法是不能取得理想效果的,而且很容
易造成细胞成骨破骨细胞凋亡和发生假复合,因此需要考虑利用有特
殊支架结构的凝胶体,或者应用其他生物材料来实现活细胞共培养。

1.4 动物实验
为了在实际应用中证实共培养体系的可行性,需要在动物实验上进行实验验证,有助于进一步用于临床应用,以达到促进骨再生的目的。

建立成骨细胞与破骨细胞的共培养体系具有重要的理论指导意义和临床应用价值,从而实现骨量的增加与骨质的维持,这不仅将有助于改善骨健康,而且有助于促进骨骼可塑性,有助于改善患者的生活质量,也是进一步改善骨病患者的治疗方法。

细胞成骨诱导实验

细胞成骨诱导实验

成骨诱导培养液配备与诱导操作:1、准备含10%FBS的α-MEM培养液;2、在备好的α-MEM培养液中添加50μM 抗坏血酸, 10mMβ-磷酸甘油和100nM地塞米松;3、准备6孔培养板,将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中;4、待细胞长至基本融合后,更换上述制备完成的成骨诱导培养液;5、每三天换液一次,细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色;6、二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。

ALP染色(G1480):1、取6孔板或其他容器培养的细胞,弃液,PBS清洗干净2、加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10~15min,PBS清洗。

3、滴加配制好的 ALP 孵育液,放入湿盒中,避光孵育 15~20min,PBS 清洗。

(第三步做完后看一下效果,看第四步要不要做)4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染 3~5min。

5、 PBS 清洗、镜检。

染色结果:ALP 活性部位蓝色细胞核红色(核固红)或绿色(甲基绿)素红染色方法介绍:1、去除细胞当前使用培养液,使用PBS清洗两次;2、使用10%甲醛室温固定15分钟,完成后使用重蒸馏水冲洗两次;3、按照1ml/孔加入0.2% PH8.3的茜素红染色液,室温孵育20min并轻微振荡;4、清除掉没有完全结合的染料,用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次;5、倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水;倒置显微镜观察拍照记录。

【先来说成骨诱导液的配制】成骨诱导液的配方,已经有好多好多的现成文章可以查询。

但是配方与配方之间,似乎总是存在些微差异,该采用谁的呢?首先基础Medium,很多人用a-MEM,有一部分人用DMEM,还有其它很多种不常见的培养液。

选择哪一种,通常是所培养细胞的一贯适用培养液。

大多数的细胞,a-MEM和DMEM几乎是通用的。

DMEM有高糖(4.5g/L)和低糖(1.0g/L)之分,有的细胞对此有要求,需要注意。

体外培养成骨细胞的研究进展

体外培养成骨细胞的研究进展

体外培养成骨细胞的研究进展
徐杨俊;赵建宁
【期刊名称】《中国骨伤》
【年(卷),期】2010(023)007
【摘要】随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞,研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性,在不同环境下可以形成骨组织,联合支架的应用,构建组织工程骨,将其植入体内修复骨缺损.现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面的研究进展作一综述.
【总页数】4页(P562-565)
【作者】徐杨俊;赵建宁
【作者单位】南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院骨科,江苏,南
京,210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院骨科,江苏,南京,210002【正文语种】中文
【相关文献】
1.补肾方剂对成骨细胞体外培养干预的研究进展 [J], 贾英民;武密山;李恩
2.成骨细胞体外培养模型的研究进展 [J], 孙中洋;李东韬;赵学武;张舒
3.电离辐射对体外培养成骨细胞影响的研究进展 [J], 李玉梅;赵铱民
4.淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展 [J], 孙海涛;丁仁
5.成骨细胞体外培养研究进展 [J], 徐展望;许波;李军
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成骨细胞与破骨细胞共培养及其应用研究进展

成骨细胞与破骨细胞共培养及其应用研究进展

Me d i c i n e , F u z h o u 3 5 0 1 2 2 , f u j i  ̄, C h i n a
ABS TRACT Os t e o c l a s t s a n d o s t e o b l a s t s a r e n o t e x i s t a l o n e, w h i l e c o mmu n i c a t i n g wi t h e a c h o t h e r t h r o u g h d i r e c t c o n t a c t , d i f f u s i b l e p a r a c r i n e f a c t o r s a n d c e l l — b o n e ma t r i x i n t e r a c t i o n . Co — c u l t u r e s y s t e m o f o s t e o b l a s t w i t h o s t e o c l a s t , i n c l u d i n g d i r e c t C O —
骨 细胞 共 培 养 的 一 个 新 的 应 用 方 向 , 将 是 应 用 于软 骨 下骨 重建 功 能 活 动 的探 讨 以 及 中 西 药干 预 骨 性 关 节 炎 的研 究 。 【 关键 词】 成骨细胞 ; 破骨细胞 ; 共培养体 系; 骨重 建 ; 药理 作 用
c u l t u r e a n d i n d i r e c t C O — c u l t u r e . I t s h o u l d b e a c c o r d i n g t o t h e r a t i o o f o s t e o c l a s t s a n d o s t e o b l a s t s u n d e r t h e p a t h o l o g y, c h o o s i n g

成骨细胞原代培养

成骨细胞原代培养

成骨细胞原代培养
成骨细胞是一类能够形成骨组织的细胞,它们可以通过原代培养的方法进行研究。

下面是成骨细胞原代培养的步骤:
1.选择合适的细胞来源:成骨细胞可以来源于小鼠、大鼠、人等,根据研究需要选择合适的动物或人类来源。

2.预处理组织:从动物或人体中取出骨骼组织,去除软组织和肌肉,然后将骨骼切成小块。

3.分离成骨细胞:用酶等物质对骨骼块进行消化,获得含有成骨细胞和间充质细胞的细胞悬液。

4.培养:将获得的细胞悬液接种在含有成骨细胞培养物的培养皿中,培养温度为37℃,CO2浓度为5%。

5.细胞传代:细胞在生长过程中会不断分裂,可以将细胞培养到达一定密度后用胰酶等物质分离,得到更多的细胞用于后续实验。

通过原代培养方法获得的成骨细胞具有更高的细胞活力和稳定性,适合用于体外研究成骨细胞的生物学特性和调控机制。

体外培养成骨细胞的研究进展

体外培养成骨细胞的研究进展
织, 联合 支 架 的应 用 , 建 组 织 工 程 骨 , 其 植入 体 内修 复 骨 缺 损 。 构 将 现就 成 骨 细 胞 的 来 源 、 化 调控 因 子 、 合 移植 及 中 分 复
医 药方 面的研 究进 展 作 一 综 述 。
【 键 词 】 成 骨 细胞 ; 细 胞 培 养技 术 ; 移植 ; 中药 关

5 2・ 6
中 国骨 伤 2 1 0 0年 7月 第 2 卷 第 7期 C iaJO to 3 hn r p& Ta m J 1 01 Vo. No7 h ru a u. 0, 1 2 23, .


综 述 ・
体外培养宁 赵
( 京 大 学 医学 院 临 床 学 院 南京 军 区南 京 总 医 院 骨科 , 苏 南京 南 江 200 ) 10 2
c n t c in o s u n i e r db n b ln e eb d e a r o ed f cs I i a t l te s u c f se ba t o sr t f is e e gn e e o e, e i a td i t o yt r p i n e e t. n t s r ce, o r eo to ls , u o t mp nh o b h i h o r g lt r c o , o o i r f a d C i e eme ii er s a c r ge s e er v e d e ua oy f tr c mp s eg a n h n s dc n e rh p o r s r e iwe . a t t e w Ke r s Ose ba t ; C l c l r e h i u ; T a s ln a in; C i e eh r a d u s ywo d t o lss el u t etc n q e u r n p a tt h n s e b l r g o

成骨细胞培养方法

成骨细胞培养方法

成骨细胞培养方法嘿,朋友们!今天咱就来讲讲成骨细胞培养方法,这可是个有趣又重要的事儿呢!你想想看,培养成骨细胞就好像是在建造一座小小的骨头城堡。

咱得先给它们准备好一个合适的“家”。

这个“家”呢,就是培养皿啦。

可别小瞧这培养皿,它得干净、无菌,就像咱自己的家要整洁干净一样。

然后呢,得给成骨细胞准备它们爱吃的“食物”,这就是培养液啦。

这培养液就像是给它们准备的大餐,得营养丰富,能让它们茁壮成长。

接下来就是关键步骤啦,要把成骨细胞小心翼翼地放到培养皿里。

这可得轻点儿、慢点儿,就像你对待一个小婴儿似的,可不能粗鲁。

然后把它们放在一个温暖舒适的地方,就像咱冬天喜欢呆在暖和的屋里一样。

这个地方要有合适的温度和湿度,让成骨细胞能舒舒服服地生长。

在培养的过程中,咱可不能偷懒哦!要时不时地去看看它们,就像你会经常去看看自己养的花有没有长好一样。

观察它们的生长情况,看看有没有什么变化。

有时候啊,可能会遇到一些小问题,比如说培养液变得浑浊啦,或者细胞长得不那么好啦。

这时候可别慌张,咱得冷静下来想想办法,是不是哪里出了问题呀?就像你遇到难题时,得静下心来思考一样。

培养成骨细胞可真是个需要耐心和细心的活儿。

就好比你种一棵树,你得天天浇水、施肥,盼着它快快长大。

培养成骨细胞也是这样,你得付出时间和精力,才能看到它们健康成长。

而且啊,这过程中还得注意无菌操作,可不能让细菌啊、病毒啊这些坏家伙来捣乱。

这就好像你要保护好自己的宝贝,不能让别人随便碰一样。

等成骨细胞培养好了,那可真是满满的成就感呀!你会觉得自己就像一个小小的科学家,完成了一项了不起的任务。

总之呢,成骨细胞培养可不是一件容易的事儿,但只要你有耐心、细心,肯下功夫,就一定能成功。

大家都试试吧,说不定你就能培养出一群健康又可爱的成骨细胞呢!。

现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作

现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作
3.培养基问题:低糖的DMEM培养基
4.培养瓶 培养瓶在接种前,使用1%多聚赖氨酸快速包被(具体方 法:每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体 ,拧上盖子,放置30min,倒掉1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBS 液冲洗两遍), 包被的培养瓶,细胞很容易贴壁 。
大鼠成骨细胞
2铝
目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等 与铝中毒有关。铝蓄积于骨骼,对骨骼和 神经系统等产生危害。文献报道低浓度铝 可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化 ,铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长 因子变化的影响。高剂量铝可抑制成骨细 胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用
3氟
氟 一方面 作为骨基质构成物参与骨形成过程 ,另一方面,过量的氟摄入可导致齿、骨等 组织及器官的损害。体外研究则表明,氟通 过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细 胞的生长速度加快、数量增多、功能增强。 氟对成骨细胞的作用与铝有所不同,需依赖 于培养液中部分生长因子,除去这些生长因 子,可消除氟对成骨细胞的作用.
传代培养步骤
1.弃除旧的培养液(可以吸,可以倒,倒的时候小心) 2.用PBS冲洗一遍(加PBS清洗或换液时,不要将细胞冲刷下来) 3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s,在显微镜下观察,细部变圆, 间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮。 4.加入含15%的牛血清培养液终止消化 5.用吸管反复细心吹打瓶底,置离心管中后,可以用PBS或DHANKS再吹打,可以反复几次,目的是将细胞尽可能的洗刷干净
样细胞不会引起明显的改变 ,而单次高剂量辐射( 400 cGy)却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的 ALP 活性增加. 2 微重力 目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质 脱钙的主要原因,特别是成骨细胞数目的减少和活性

成骨培养基诱导分化的原理

成骨培养基诱导分化的原理

成骨培养基诱导分化的原理成骨培养基呢,就像是一个魔法药水,能让一些细胞走上成为成骨细胞的奇妙道路。

你想啊,细胞原本就像一群懵懵懂懂的小娃娃,不知道自己将来会变成啥样。

成骨培养基就像是一个超级导师,开始引导这些细胞啦。

成骨培养基里有好多关键的成分呢。

比如说,有一些矿物质成分,这就像是给细胞们准备的小砖头。

钙和磷这对好伙伴就在里面起着超级重要的作用。

钙就像是建筑中的骨架,它能让细胞构建的结构有一定的硬度。

磷呢,就和钙一起配合,就像它们俩手拉手,形成那种钙磷复合物,这就为未来成骨细胞构建骨骼的基础结构打下了根基。

这些矿物质就像在告诉细胞们:“小家伙们,咱们要开始盖房子啦,先把这些基础材料准备好哦。

”还有呀,成骨培养基里常常有一些生长因子。

生长因子就像是细胞的小激励师。

比如说骨形态发生蛋白(BMP),这可是个厉害的角色。

它就像一个热情的拉拉队长,在细胞周围喊着:“加油呀,你们可以变成成骨细胞的!”BMP能激活细胞内部的一些信号通路,就像是打开了细胞身体里的一些特殊开关。

一旦这些开关被打开,细胞就像是接收到了特殊指令,开始朝着成骨细胞的方向转变。

它们会开始合成一些特殊的蛋白质,这些蛋白质就是构建骨骼的重要材料呢。

维生素D也是成骨培养基里的重要成员。

维生素D就像一个阳光小使者。

你知道的,咱们晒太阳可以获得维生素D,而在培养基里的维生素D也有着类似的重要性。

它能调节细胞对钙的吸收和利用。

就好比是一个智慧的管家,告诉细胞:“钙这个小砖头要这么用才最合理哦。

”这样细胞就能更好地利用钙来构建骨骼结构啦。

另外呢,成骨培养基里还会有合适的酸碱度等条件。

这就像给细胞们创造了一个舒适的小环境。

如果酸碱度不合适,细胞就会觉得像住在一个很糟糕的房子里,它们可能就没法好好听成骨培养基这个导师的话啦。

合适的酸碱度就像是一个温馨的小窝,让细胞们能够安心地接受诱导分化的指令。

而且呀,这个诱导分化的过程不是一蹴而就的。

细胞们要经历一个循序渐进的过程。

细胞成脂或成骨诱导的具体方法及注意事项

细胞成脂或成骨诱导的具体方法及注意事项

细胞成脂或成骨诱导的具体方法及注意事项
一、技术简介
干细胞和祖细胞群体存在于多种成体组织中,包括皮肤、肌肉、骨髓和脂肪。

越来越多的研究表明这些细胞可能具有多系分化的潜能,能够生成除来源组织以外的细胞类型。

近年来,人们发现成体脂肪组织可作为间充质干细胞另外一个丰富的来源。

这残细胞被命名为脂肪来源的干细胞(ASCs)。

在特定的培养条件下,ASCs可诱导分化为多种间充质和神经类型细胞。

二、实验流程
成骨诱导培养液配备与诱导操作
1. 准备含10%FBS的α-MEM培养液。

2. 在备好的α-MEM培养液中添加50μM抗坏血酸,10mM β-磷酸甘油和
100nM地塞米松。

3. 准备6孔培养板,将细胞接种于原始α-MEM培养液。

4. 每三天换液一次,细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色。

5. 28天后再进行矿化结节的茜素红染色。

成脂诱导培养液配备与诱导操作
1. 配置PBS10%含量的HG-DMEM培养液。

2. 在配置完成的HG-MEM培养液中加入10μM地塞米松、10μg/ml胰岛素、200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX。

3. 准备6孔培养板,将细胞接种于原始HG-MEM培养液中。

4. 待细胞长至基本融合后,更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天,在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天,如初交换培养至14天,使用红油O染色。

成骨细胞的体外培养与鉴定

成骨细胞的体外培养与鉴定

成骨细胞的体外培养与鉴定☆
王 勇平 ,廖 皴 ,蒋 矗
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王 勇平 , 廖 皴 ,蒋 壶 . 骨 细 胞 的 体 外 培 养 与 鉴 定 [ . 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复 ,2 1 , 1 (3: 3 —2 4 成 J中 】 0 1 53 ) 2 1 3 6 6
Abs r ct ta BACKGROUND: e me h so s e b a t ut r 『 vt a e c r n l i t s Th t od fo t o l s l e 门 i o h v e t i t i c u r ai m a on . 0BJE CTI VE: u TO s mmar e os e b a ts u c i i o c t e me h d, ul r on ion a d ien ic t n s g s i t o l s o r e,n vt ul t o c t e c d t , n z r ur u i d t ai in i f o M ET HODS: c A omp t rb e e r v s p r med i bMe n a f n da a a e e c u e - as d r ti al e wa e f or n Pu d a d W n a g t b s s t s ar h man s rp s p b ih d o u c i t u l e s b t e 0 0 an 01 t h eywo ds s e bls . e l ul e i e t c t n”i En i h a d Ch n s n ua e . e p p s e we n 2 0 d 2 wi t e k r ”o t o a t c l c t , d n i a i 0 h ur i f o n gl n i e e l g g s Th a er s a d s r i g i i o c l e an n ic t n o s e b a t r n lde . e c i n vt ut d i t ia i fo t o l s s we e i c u d Rep t ie r s a c n b n r ur de f o e i v e e r h a d Met n y i r c u e t a a alss we e ex l d d. RESULT AND S CONCLUSl ON: i h e e o m e t f e l ut r hnqu s/ i o. s e b a t r W t t ed v lp h n lc l et oc u ec i e n vt o t o l s s f r 0m n ma on ai I b e. p i t u . on er e m b e mar w nd n n b n is e h v e u c s f l ut r d. u i a e s o h t h s t o l s s h v os r a o . o e l u a e be n s c e s ul c l e St des h v h wn t a e e os e b a t a e o s y u t t p c l h a t it s a d g od b o o ia r p t e . ren l, h ut r d os e l t e c m mo x e i n a de t y i a ar c er i n o i l g c l o er s Cu r t t e c l e t obass ar o c sc p i y u n e p rme t l mo ln v r ii o
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鄙人做成骨细胞培养检测相关指标,走了许多弯路,今将自己的总结的经验贴出,望后续战友做成骨细胞培养时少走弯路,加快实验进程,不要把过多的时间耗费在培养上!
1.成骨细胞的取材:
选取新生SD大鼠的乳鼠(有参考书上新生24h的,鄙人试过72h的乳鼠,消化下来的成骨细胞活力也是很不错的),具体取材方法不详述。

2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中(PBS不要放太多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成1*1mm的组织快,越小越好(越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml,37℃水浴中消化30min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入2ml胶原酶2,水浴中继续消化1h(中间间隔晃动,使消化下来的胶原离开团块溶于液体中)。

如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加适量的PBS,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。

离心后去掉上清液,用PBS悬浮细胞,如果发现还有很多的骨片,将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化,第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀(如果担心胶原酶2会影响细胞的生长,可以将两次的悬液离心,去掉上清液后,用培养基重悬)
3.培养基问题:
当时选取培养基问题确实弄苦了自己,因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM,所以也用这个,但是消化下来的细胞很难成活,后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基,消化下来的细胞完全可以成活下来。

但是问题接踵而至,到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%,此时只要一换液,第二天绝对培养基混浊,没有一瓶细胞活过7天的(比如今的公司倒闭的都快),怀疑是污染问题(因为正值夏季雨天),折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用,死亡现象依然在上演。

后来联系到丁香园的一个战友,他那里用的是低糖的DMEM培养基,没有出现我的问题,
建议我换用这个!我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基,使用后细胞生长良好,繁殖旺盛!没有出现死亡漂浮现象!
个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的(相比神经细胞,肾细胞等),高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原(类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪),另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠,一换液就会漂浮,将细胞从底壁带下来。

4.培养瓶
起初偶使用的是25ml的玻璃培养瓶,这个东西简直太轻了,手指一触,它就乱动,后来改用50ml玻璃培养瓶,一只老鼠的头盖骨消化下来的细胞接种到50ml培养瓶中,7天后完全可以传代。

见有参考书上讲5只老鼠的头盖骨接种到一个培养瓶中,简直是涂炭生灵,浪费大大的!
偶用的培养瓶在接种前,使用1%多聚赖氨酸快速包被(具体方法:每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体,拧上盖子,放置30min,倒掉1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBS液冲洗两遍),加进细胞悬液后,适度摇晃几次,是悬液均匀铺在瓶底!这样可以避免底壁出现细胞不均匀的现象,包括传代时也要如此。

包被的培养瓶,细胞很容易贴壁,我观察的是15min后就完全贴壁。

5. 关于培养基的PH值问题
市面的上的PH试纸真的不是很准确,测多了都不相信自己的眼睛了。

鄙人利用血气分析仪器,确定了到100ml培养基加多少ml的1M的NaOH,后来发现不调PH值的培养基中细胞也活的很好,完全不是查阅到的论文一定要把PH值细胞才能活下来。

建议不调最好,调过了细胞死翘翘了,真不知道问题出在哪里!尽量不要调PH值,勾兑上血清直接使用完全可以。

还有一个问题是GIBCO的粉状培养基配制是要加碳酸氢钠的(GIBCO牌子培养基特别搞
笑,一大盒培养基里面有10小包,大盒子的外面包装上注明了加多少的碳酸氢钠,但里面的小包上面完全没有,如果你只购买了一小包,千万别忘了问试剂公司大盒子上面注明的碳酸氢钠加入的量),如果你老板有钱,那你就买液体的,省的费时配制!
5.有关污染的问题
加了双抗的培养基很少会引起细菌感染的,真菌感染就难预防了,特别是在夏季比较潮湿,真菌孢子空气里游荡的很多,一不小心飘进一个就污染,几天后就在培养瓶中变成一大团。

将50ml的培养瓶加上3ml培养基,盖子拧松放置在CO2孵箱里21天,盖子下缘长满了绿毛毛,但是培养基依然澄清!所以推论,孵箱里虾兵蟹将的真不少。

处理完培养瓶,用酒精纱布搽试瓶盖和瓶颈。

如此做下来没有出现过污染的问题!
鄙人使用的是国产的牛血清,感觉还不错,没有想象中支原体问题严重。

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