胚胎工程最新进展论文

胚胎工程之胚胎分割

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，胚胎工程技术内容丰富，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

胚胎工程技术广泛用于生殖生物学、胚胎学、发育生物学、遗传育种学和生殖医学的研究应用，并成为这些研究领域的重要技术手段。目前在生产上应用较多的是动物繁殖控制技术，包括人工受精技术、试管家畜技术、胚胎分割技术等。胚胎工程是生物技术的重要组成部分，它的研究和应用不仅推动了制药、器官移植医学等领域的变革，而且还加速了畜牧业生产的发展。目前我国在胚胎移植改良牛、羊品种，体细胞克隆牛、羊等家畜的技术方面已经进入国际先进行列。

从本世纪的三十年代起，胚胎工程技术就逐步成功地应用于畜牧业生产，尤其是在优良种畜的引进、品种的保存、种畜的迅速扩繁、品种的改良和濒危动物的保护等方面发挥了极其重要的作用，极大地提高了畜牧生产的科技水平，产生了巨大的经济效益和社会效益。胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的新技术。实际上是动物细胞工程的拓展与延伸。早在１８９１年，英国剑桥大学的赫普就在兔子身上首次成功地进行了受精卵的移植实验。

到本世纪３０年代，这项技术已在畜牧业上获得了越来越明显的效益。进入７０年代，出现了专门从事受精卵移植的企业。高等动物的受精卵移植又叫“家畜胚胎移植”。它是将优良种畜的早期胚胎从供体母畜体中取出来，移到受体母畜输卵管或子宫中，“借腹怀胎”繁殖优良牲畜的技术。

为成倍甚至成数倍地提高优良胚胎移植后所得到的成体数，用显微外科的手术方法将一个胚胎分割为２个或多个，制造同卵多仔。国内外科学家们已在鼠、兔、牛、羊、猪的胚胎分割上取得了成功，这一技术成为胚胎分割

胚胎分割（Embryo bisection）是指借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。由于来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。胚胎分割技术可用于扩增可用的优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的克隆动物，可用于濒危动物的保护，也可为早期胚胎遗传疾病的检查和性别鉴定等技术提供一种活体组织检查的方法。

胚胎分割的研究概况

早在1904年，Spemann就进行了蛙类2细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双生后代。20世纪30年代，Pincus等首次证明2细胞兔胚的单个卵裂球在假孕受体兔体内可发育为体积较小的胚泡。哺乳动物胚胎

分割技术始于Nicholas( 1942) 对大鼠22细胞胚胎卵裂球的分离和

培养研究。其后,1959 年Tarkow ski研究了小鼠1/4 ,2/4 ,3/4 卵裂球的发育规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来，随着胚胎培养及移植技术的发展和完善，哺乳动物胚胎分割取得了突破性进展。1979年，Willadsen等通过分离2细胞胚胎的卵裂球，也获得绵羊同卵双生后代。20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术进人快速发展时期。1998 年,Rho 等又利用卵母细胞体外培养成熟、体外受精的方法获得了牛胚胎,移植12 枚四分胚给6 头受体,获得2 头四分胚的犊牛,这是第一次利用体外胚分割得到活体后代。当然,胚胎并不是随着分割次数的增加,产生的克隆动物就越多。如果超过四分割以上则产生的克隆动物个体数可能反而减少,甚至一个也得不到。为了使胚胎分割技术更便于在生产中推广应用,一些学者开始对这种显微操作技术加以改进,简化其方法并避免使用昂贵仪器,而采用在体视显微镜下徒手操作的简易方法进行胚胎分割。1988 年Williams 用止血钳夹住用刮胡刀片制成的显微手术刀片分割7龄

牛胚得到了同卵双生牛犊。

我国家畜胚胎分割及相关的研究工作，自20世纪80年代晚期以后进展也很快。1986 年窦忠英等得到了国内首批分割胚牛犊(单生) ,该实验将分割所得的半胚装入透明带后移植受体与裸胚直接移植受

体的产仔率均为25 %。谭丽玲等（1988年）对兔胚胎进行了半胚分割，并获得仔兔。1989年，江苏农科院、中科院遗传所获得山羊鲜胚分割羔羊；同年，张涌等也获得了山羊鲜胚和冻胚分割羔羊；此外，我国

的研究人员也把胚胎分割与胚胎性别鉴定有机结合，推动了胚胎分割的深人研究和推广。

胚胎分割原理

早期实验胚胎学的研究发现,大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育,即去掉一个早期胚胎的一半,剩余的部分可以调整其发育方向,仍可以发育为一个完整的胚胎。反之,若把两个早期胚胎融合在一起,它们不是发育为两个连在一起的胚胎,而是在细胞间重新调整,仍发育为一个胚胎。但随着发育进程,其调整能力逐渐减弱,细胞的组织发育方向变得越来越固定,直到调整能力完全丧失。

早期的实验胚胎学证明哺乳动物2细胞期的每个卵裂球都具有发育为正常胎儿的“全能性”。对小鼠胚胎分割的实验认为,在32 细胞期的胚胎仍具有调整能力,但到64 细胞期的胚胎就逐渐失去这种能力。到神经轴时期的胚胎,再分割为两半,就永远不会发育为正常的胚胎了【1】。

胚胎分割方法

1、毛细管吹吸法

该方法主要适用于分离2细胞到8细胞期卵裂球。在显微操作仪的帮助下,在无钙、镁离子的培养液中,用固定针吸住胚胎,用另一玻璃针挑开胚胎的透明带,细胞团自透明带中脱出。再用仅能通过胚胎的

毛细管吹吸胚胎,得到单个卵裂球,再将卵裂球装入空的透明带中,体外培养至一定时期,移植入受体中。

2、徒手分割法

该法主要适用于分割体积较大的胚胎,其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下,用止血钳夹住切割刀片,将透明带切开一部分,再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次,胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑葚胚和囊胚。

3、显微手术法

这种方法主要适用于分割桑堪胚和囊胚。在显微操作仪的帮助下,以固定针吸住胚胎,用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。在切割桑葚胚时,需要在不含钙、镁离子的培养液中,以降低细胞间的连接,降低由于切割造成的损伤。对胚胎的分割要注意对称,尤其是囊胚,

要注意将内细胞团对称地一分为二。但这种方法与徒手分割相比无论切割有效率还是移植产羔率都是最低的。并且玻璃针带内切割需要昂贵的显微操作系统,因此这种切割方法在实践中很难得到推广应用【2】。

4、酶消化法去透明带后分割法

5、免疫手术法

胚胎分割操作流程