新型自体肿瘤细胞疫苗治疗进展期肿瘤患者的免疫学检测

第25卷第1期2004年2月西安交通大学学报(医学版)
J o u r n a l o fX i 'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y
(M e d i c a l S c i e n c e s )V o l .25N o .1
F e b .2004
新型自体肿瘤细胞疫苗治疗进展期肿瘤患者的免疫学检测
姚德茂1,尹贻明2,张亚玲1,李 旭1,崔 玲1,孟绍青1,司履生3,王一理3
(1.西安交通大学第一医院外科,陕西西安 710061;2.陕西省人民医院,陕西西安 710068;
3.西安交通大学癌症研究所,陕西西安 710061
)摘要:目的 探讨自体肿瘤疫苗的作用机制。

方法 20例进展期肿瘤患者术后第4周开始以自体肿瘤细胞疫苗行主动免疫治疗。

免疫接种共4次,每次间隔7～10d
;接种前3d 及第4次接种后一周,采集外周血,分离单个核细胞,以流式细胞分析术/细胞内细胞因子检测法测定C D 8+I F N -γ+,C D 8+I L -10+细胞及C D 4+I F N -γ+
,
C D 4+I L -10+细胞;同时采集血清,E L I S A 法检测血清I F N -γ、I L -10水平。

结果 自体肿瘤细胞疫苗治疗后:①血清I F N -γ水平升高
[(7.16±2.91)n g ·L -1升至(11.68±4.86)n g ·L -1,P <0.05];而I L -10水平下降[21.04±13.81)n g ·L -1降至(13.41±5.71)n g
·L -1,P <0.05];②C D 8+I F N -γ+阳性细胞由(3.80±1.45)%升至(6.94±2.63)%;C D 4+I F N -γ+阳性细胞由(3.09±1.52)%升至(5.20±2.94)%(P <0.05);③病人耐受良好。

结论 自体瘤细胞疫苗免疫后可改善肿瘤患者细胞介导的抗瘤免疫反应。

关键词:进展期肿瘤;肿瘤主动特异性免疫治疗;自体肿瘤疫苗
中图分类号:R 730.51 文献标识码:A 文章编号:1671-8259(2004)01-0083-03
I m m u n o l o g i c a l e v a l u a t i o no f an o v e l a u t o l o g
o u sw h o l e t u m o r c e l l v a c c i n e f o r t r e a t i n gp
a t i e n t sw i t ha d v a n c e d t u m o r Y a oD e m a o ,Y i nY i m i n g ,Z h a n g Y a l i n g ,L i X u ,C u i L i n g ,M e n g S h a o q i n g ,S i L m s h e n g ,W a n g Y
i l i (D e p a r t m e n t o f S u r g e r y ,F i r s tH o s p i t a l o fX i 'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y ,X i 'a n710061,C h i n a )A B S T R A C T :O b j e c t i v e T oe v a l u a t et h ei m m u n o l o g i c a l p a r a m e t e r so f p a t i e n t sw i t hr e s e c t e da d v a n c e dt u m o r a f t e r a c t i v e i m m u n o t h e r a p y u s i n g an o v e l a u t o l o g o u sw h o l et u m o rc e l l v a c c i n e .M e t h o d s T w e n t yp o s t -o p
e r a t i v e p a t i e n t sw i t ha d v a n c e d t u m o r sw e r e e n r o l l e d i n t h i s s t u d y .T h ev a c c i n a t i o nw a s s t a r t e da t 4w e e k s a
f t e r r e s e c t i o n t o a l l o wt h e p a t i e n t s s u f f i c i e n t t i m et or e c o v e rf r o mi m m u n o l o
g i c a l s u p p r e s s i o ni n d u c e db y s u r g e r y
.T h ev a c c i n a t i o n w a s i na t o t a l 4w e e k s s c h e m ew i t ha n i n t e r v a l o f 7～10d a y s .I n t r a c e l l u l a r c y t o k i n eo fC D 8+I F N -γ+
,C D 4+I F N -γ+,C D 4+I L -10+,a n dC D 8+I L -10Tc e l l i nP B MN C w e r ed e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y 3d a y sb e f o r ea n d 7d a y
s a f t e r t h e f i n a l i n o c u l a t i o n ;s e r u ml e v e l o f I F N -γa n d I L -10w a s a s s a y e db y E
L I S Aa t t h e s a m e t i m e .R e s u I t s T h e s e r u ml e v e l o f I F N -γw a s e l e v a t e d (7.16±2.91n g ·L -10s 211.68±4.86n g ·L -1,P <0.05)w h e r e a s I L -10w a s d e c l i n e d (21.04±13.81n g ·L -10s 213.41±5.71n g ·L -1,P <0.05);C D 8+I F N -γ+
Tc e l l sw e r e i n c r e a s e df r o m (3.80±1.45)%t o (6.94±2.63)%;C D 4+I F N -γ+
Tc
e l l sw e r e i n c r e a s e d
f r o m (3.09±1.52)%t o (5.20±2.94)%(P <0.05).T h e p a t i e n t ss h o w e d
g o o dt o l e r a n c e .C o n c I u s i o n I n o c u l a t i o n w i t ha u t o l o g o u st u m o rv a c c i n ec a n i m p r o v e t
h e c e l l -m e d
i a t e da n t i -t u m o r i m m u n o -r e s p
o n s eo f t u m o r p a t i e n t s .K E Y W O R D S :a d v a n c e d t u m o r ;t u m o r s p e c i f i c a c t i v e i m m u n o t h e r a p y ;a u t o l o g o u s t u m o r v a c c i n e 收稿日期:2003-02-09 修回日期:2003-06-26
基金项目:陕西省卫生厅科学基金(N o .9929);
西安交通大学博士流动基金资助(N o .011004
)通讯作者:王一理,E m a i l :w a n g y i l i @m a i l .x j t u .e d u .c n 作者简介:姚德茂(1962-),男(汉族),外科学博士,副教授.
肿瘤患者的预后与机体细胞免疫状态有密切关
系是不争的事实[
1]。

手术切除肿瘤,减轻瘤负荷,然后进行自体肿瘤细胞瘤苗主动免疫治疗,是目前肿瘤
主动免疫治疗的主要策略[2]。

我们对20例进展期肿
瘤患者术后行自体肿瘤细胞疫苗主动免疫治疗(a c -t i v e s p e c i f i c i m m u n o t h e r a p y
,A S I ),观察其细胞免疫功能变化,探讨其抗瘤作用机制。

1 对象和方法
1.1 研究对象 为1996年9月至2001年4月在本
院住院的进展期肿瘤患者20例,男15例,女5例,年龄48～65岁。

其中食管癌3例(s t a g
e Ⅱ～Ⅲ),肾癌2例(s t a g e Ⅲ),胃癌5例(s t a g e Ⅱ～Ⅲ),结肠癌10例(s t a g
e Ⅱ～Ⅲ)。

入选条件:病理诊断为进展期肿
西安交通大学学报(医学版)第25卷
瘤;术后病人愿意接受A S I,而不愿意接受放疗、化疗或其他免疫治疗;术后因病情需要,曾行放疗或(和)化疗,但在A S I前,放疗或化疗已停用3～6月以上;术后曾行放疗或(和)化疗,但不敏感或因毒副作用中断治疗,愿意接受A S I之前,停用放疗或(和)化疗3～6月以上者;一般情况K a r n o f s k y评分*60分,并预计生存时间*3月的病人;肝肾功能正常;骨髓功能正常。

1.2方法
1.2.1自体肿瘤细胞疫苗的制备分离肿瘤细胞:将手术切除的新鲜肿瘤标本立刻放入含50
µg·m L-1庆大霉素的H B S S中,无菌快速送至实验室,超净台内以含抗菌素的H B S S洗涤3次,去除坏死组织、脂肪组织和周围的正常组织,以手术刀片切碎至<1m m3后,置入含有胶原酶、透明质酸酶和D N A酶的混合液中,37j下消化2～4h;不连续梯度离心2000r·m i n-1×20m i n,收集肿瘤细胞,以H B S S洗涤3次,台盼兰排斥试验计数活细胞达80%以上,调细胞浓度至2×107·m L-1,-70j低温冰箱冷冻,液氮冻存备用。

疫苗制备:取冻存的瘤细胞, 37j快速复苏,以含10%(体积分数)人A B血清的R P M I1640培养基洗两次,悬浮于0.5m L生理盐水中,反复冻融5次,并用细胞匀浆器研磨以灭活瘤细胞。

加重组人白细胞介素2(r I L-2)10万单位、重组人粒细胞单核细胞集落刺激因子(r GM-C S F)50µg、特制中药提取物及福氏不完全佐剂,总体积1m L,制成油包水乳剂疫苗及水剂疫苗(水剂疫苗除不含福氏不完全佐剂外,其余同上)。

1.2.2免疫程序手术后第4周开始A S I治疗,术后因病情需要放疗或化疗者,在放、化疗停用4周后,再行A S I治疗。

A S I治疗分4次接种,每次间隔7～10d;每次接种4个部位,以邻近淋巴结为佳(即双大腿内侧近腹股沟淋巴结处,上肢近腋窝淋巴结处)。

第1、2次为含福氏不完全佐剂的疫苗;第3、4次为不含福氏佐剂的疫苗。

第1、2次免疫后,每天肌肉注射r I L-210万单位和GM-C S F50µg,连用3d。

1.2.3免疫效果评价主动免疫治疗前3d,第4次免疫治疗后一周,采集病人外周静脉血(抗凝),经不连续梯度离心,分离单个核细胞,以流式细胞分析术/细胞内细胞因子检测分析治疗前后外周血淋巴细胞中C D8+I F N-γ+,C D8+I L-10+细胞及C D4+I F N-γ+、C D4+I L-10+细胞;C D4-F I T C、C D8-F I T C单抗及I F N-γP E、I L-10P E单抗及细胞内细胞因子检测试剂盒购自晶美生物公司(为p h a r m i n g e n公司产品),并同时采集病人血清,以E L I S A法检测血清中I L-10、I F N-γ水平,人I F N-γ,I L-10E L I S A试剂盒为美国G e n z y m e公司产品。

试验过程依照说明进行。

结果判定:以标准品的A值减去空白对照孔的A值为绝对值,绘制标准曲线,根据待测样本的A值,计算待测样本的I L-10、I F N-γ浓度。

1.2.4统计学处理采用配对t检验。

2结果
2.1细胞内细胞因子检测结果20例进展期肿瘤患者术后,辅助A S I治疗,结果发现:C D8+I F N-γ+细胞比例明显升高(P<0.05),C D8+I L-10+细胞比例下降(P<0.05);C D4+I L-10+细胞比例明显下降(P <0.01),C D4+I F N-γ+细胞比例明显升高(P< 0.05)。

提示自体肿瘤疫苗治疗后,可刺激特异性细胞介导的免疫反应(表1)。

表1A S I治疗前后C D4、C D8细胞表型变化
T a b l e1C h a n g e s o fC D4a n dC D8c e l l sb e f o r e a n da f t e rA S I
(x±s,-=20,%) I m m u n e p a r a m e t e r B e f o r eA S I A f t e rA S I P V a l u e C D8+I L-10+10.64±7.016.04±3.17<0.05
C D8+I F N-γ+3.80±1.456.94±2.63<0.05
C D4+I L-10+4.26±1.721.06±0.45<0.05
C D4+I F N-γ+3.09±1.525.20±2.94<0.05
2.2血清I F N-γ/I L-10水平变化结果显示:I F N-γ浓度明显升高(P<0.05),I L-10浓度下降(P< 0.05)(见表2)。

表2A S I治疗前后血清中I F N-γ、I L-10水平变化
T a b l e2C h a n g e s o f s e r u mI F N-γa n d I L-10b e f o r e a n da f t e r A S I(x±s,-=20) I m m u n e p a r a m e t e r B e f o r eA S I A f t e rA S I P V a l u e I F N-γ/p g·m L-17.16±2.9111.68±4.86<0.05
I L-10/p g·m L-121.04±13.8113.41±5.71<0.05
2.3不良反应红斑、肿胀及疼痛是最常见的局部表现,发生率90%(18/20);但无溃疡发生。

红斑、肿胀及疼痛持续约3～8d,即自行消退;硬结持续时间较长,1～3月后缩小或消退。

全身反应包括:短暂性发热(T<38j),发生率35%(7/20),未予特殊治疗好转;乏力(困)发生率100%(20/20),持续3～6d,自行减轻;寒战、恶心及呕吐发生率极低,分别为5%(1/20),程度缓和,可不予特殊处理。

无肝肾功能损害及全身自体免疫疾病发生(如关节炎、皮肤血管炎等)。

3讨论
研究发现,大多数肿瘤具有免疫原性,可被荷瘤
4 8
1期姚德茂,尹贻明,张亚玲,等.新型自体肿瘤细胞疫苗治疗进展期肿瘤患者的免疫学检测
宿主的免疫系统所识别[3]。

一般认为强免疫原性肿瘤引起Ⅰ型免疫反应,活化的肿瘤特异性T细胞可引起肿瘤排斥,而弱免疫原性或所谓的无免疫原性肿瘤则引起Ⅱ型免疫反应,无抗瘤效应,肿瘤持续生长[4]。

特异性主动免疫(自体疫苗)治疗的策略就是通过佐剂等修饰手段,可能改变肿瘤的免疫原性,使Ⅱ型免疫反应转化为Ⅰ型免疫反应,刺激有效的抗瘤效应。

本研究对20例进展期肿瘤患者术后,辅助自体肿瘤细胞疫苗主动免疫治疗。

治疗前后相比, C D8+I F N-γ+及C D4+I F N-γ+阳性细胞比例明显升高,而C D8+I L-10+及C D4+I L-10+阳性细胞比例明显下降;血清I F N-γ和I L-10水平的变化与免疫效应细胞的变化一致。

提示自体肿瘤疫苗免疫可引起特异性细胞免疫反应(Ⅰ型),特异性细胞毒性T细胞(C T L)数量增多,推测在杀灭残留癌细胞,抗肿瘤复发、转移中起重要的作用[5]。

I L-2及GM-C S F是具有多种生物活性的细胞因子。

近年来,在肿瘤免疫治疗中的作用倍受重视。

局部小剂量应用I L-2及GM-C S F,对增强抗原提呈细胞活性,活化抗原特异性C T L,引起有效地抗瘤免疫反应有重要作用[6]。

本研究在自体肿瘤细胞瘤苗制备中,加入小剂量I L-2及GM-C S F,并在第1、2次免疫后3d内,肌肉注射小剂量I L-2及GM-C S F,方法简单且无不良反应,取得了较满意的结果。

B C G是目前应用最广的佐剂,动物实验中,加入
1.0×107活B C G,可明显提高肿瘤细胞疫苗免疫的效果[7,8],但应用含活B C G的福氏完全佐剂,最常见、最严重的局部不良反应是接种部位皮肤溃疡,发生率达90%～100%,愈合慢,临床处理困难,给患者心理、生理带来了诸多不便。

本研究在动物实验的基础上,对瘤苗佐剂进行了改进。

以福氏不完全佐剂为基础,除了加入I L-2、GM-C S F外,以特制中药提取物替代B C G,制成油包水乳剂自体肿瘤细胞瘤苗,应用后观察发现:所有患者耐受性良好,无皮肤溃疡及严重不良反应发生。

总之,本研究用改良的免疫佐剂及自体肿瘤细胞抗原,制备肿瘤疫苗,免疫后观察受试者免疫反应参数的变化,结果提示该策略可明显改变患者的抗瘤免疫反应,表现为Ⅰ型反应增强,但对患者无瘤生存期、总生存期的影响尚需扩大病例数及长时间随访。

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(编辑邱芬)
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8。