柠檬酸发酵原理

传播污染的四大媒介－人
第四个帮凶可能是大家都不会想 到的，它就是我们自己，人体是一个 永不休止的污染媒介。当您每天来工 厂上班时，您也许随身将几百万细菌
带入工厂。
人员污染的途径和方式
人的头发和皮肤：每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微
生物
嘴巴和鼻子——水滴：呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，
•
2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激 酶的作用下，生成草酰乙酸
碳平衡和能量平衡
3/2O2 3H2O
9ADP 9ATP
2ADP
2ATP
2H2
C6H12O6 丙酮酸脱羧 CO2固定 C4C2缩合
EMP途径
2×C3H4O3
C 6 H8 O7
柠檬酸
H2 O
思考 EMP、HMP、TCA存在大多 数真核生物细胞中，但是为什 么黑曲霉能够大量积累柠檬酸 呢？
黑 曲 霉 生 长 周 期
发酵常见染菌及区别
一、酵母菌是一些单细胞真菌，体积较细 菌较大 ，1~5微米*5~30微米，而细菌直 径或宽度不超过1微米，长不超过5微米， 有氧无氧均可生存，低PH也可生存。
二、细菌主要由细胞膜、 细胞质、核质体等部分构 成 ，球菌、杆菌和螺形 菌 ，低PH难以存活，易 自溶。
了解了黑曲霉及其制备过程，了解 了发酵底物的组成及来源，那黑曲霉 是如将这些底物转变为柠檬酸的呢？ 总述：萄葡糖首先通过糖酵解（ EMP）／磷酸戊糖途径（HMP）得 到磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸，然后 经过一个不完整的三羧酸循环达到柠 檬酸的积累。
EMP（糖酵解）
• 糖酵解是生物体进行单糖的分解和利 用的主要途径之一，糖酵解总共包括 10个连续步骤，均由对应的酶催化。 • 不仅是黑曲霉，许多生命体都存这种 获取能量的方式
• 2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失
或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止 。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤） • 3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 • 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2 重新氧化时所需 • 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧
发酵底物来源
黑曲霉生长培养基 培养基的成分对微生物发酵产物的形成有很大 的影响，必满足微生物的能量、元素和特殊养 分的需求，如下： C源+N源+矿物质+O2 新增细胞+目标产物 +CO2+H2O+△H C源：葡萄糖 N源：有机氮和无机氮
葡萄糖来源
玉米、木薯等原料 淀粉 糊精 葡萄糖
柠檬酸
黑曲霉发酵柠檬机制
导致侧呼Biblioteka Baidu链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。
与现生产结合
• 温度影响 • 无菌生产的重要性
温度影响
微生物生长周期
介质
一般空气中 土壤 严重污水 人的头皮 人的两手 1g指甲污垢 1g粪便
微生物含量
800~3500个/m3 1~500亿个/g 107个/ml 100-150万个/cm2 4~40万个 30亿-40亿个 10~1000亿个
柠檬酸生物合成的代谢调节
• （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
• 1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑 制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活 作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激 酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由 于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累 的大量柠檬酸不敏感。这就是为什么种子罐不添加 硫铵，PH下降慢，酸度低。
传播污染的四大媒介－水
第二个帮凶是水，从理论上来讲，微生物在纯水中是不 能生长的。但是，所有的各类水，不管怎样仔细地蒸溜 或过滤，总会含有一定量的可溶性有机物和盐类。正是 这些可溶性的物质可被微生物利用作为它们生长的养料 源泉。
传播污染的四大媒介－表面
第三个帮凶是表面，包括：天花板、墙壁、地面、设备、 容器、工具或桌子； 由于空气中的湿度，所有表面都包上一层含水的薄膜。这 层薄膜由于静电吸引而饱含尘埃微粒，有很多时候，表面 还覆盖一层油状物质，此层油膜易受到尘粒污染。 表面因尘埃微粒和微生物由空气传播的回降而受到污染。 请记住：一个表面看起来很干净，而实际上已经被千百万 个微生物所污染，除非已经做了正确的消毒灭菌。
小概念：三磷酸腺苷，简称为ATP，其中A表示腺苷，T表示其数量 为三个，P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团。其结 构简式是：A—P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常 活跃，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量。
EMP途径
糖酵解特点
1、它是一个产能的过程，虽然在第1、3步中消耗了两分子ATP, 但在第7、10步中却又生成了4分子ATP,所以是一个产能过程。三 磷酸腺苷，简称为ATP，其中A表示腺苷，T表示其数量为三个， P表示磷酸基团，即一个腺苷上连接三个磷酸基团。其结构简式 是：A—P～P～P，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃 ，水解时可释放约30.54kJ/mol的能量。2、糖酵解过程不消耗氧 分子3、与HMP途径有共同中间产物——6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘 油醛，HMP途径就是通过这两种物质与糖酵解互相 沟通。4、1、3、10步是不可逆反应，这就不难解释为什么不管 是EMP还是HMP途径最终都能生成丙酮酸，因为可逆反应都是朝 着浓度低的方向进行，生成丙酮酸的反应不可逆，生物体内的烯 醇式磷酸丙酮酸就会越来越少，因此第9步反应就会朝向烯醇式磷 酸丙酮酸方向进行，以此类推，在酶的活性不受干扰的情况下， 萄葡糖通过EMP和HMP途径生成丙酮酸。 丙酮酸的生成并不是柠檬酸合成专属的物质。在有分子氧存在的 情况下，才能进入三羧酸循环（TCA），而在缺氧的情况下，则 会进行乙醇、乳酸等物质的发酵。
微生物存在的状态
多数附着 于灰尘
芽孢病毒 悬浮空气
沉积地 表、土 壤、水
1μm以下者处于悬浮状态， 10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘
传播污染 四大媒介
空气
水
表面
人
传播污染的四大媒介－空气
• 传播污染的第一帮凶就是空气，空气携带着噬菌体 来污染我们的厂区。每立方米的空气中至少含有60 万颗尘粒，还存在着大量的微生物。 • 因此，要杜绝带有大量尘埃微粒和微生物的空气污 染办法是对空气采取过滤的措施，把隐藏在空气中 的敌人通通过滤掉，使空气质量达到我们的要求。 这就是要建立密闭厂房和空气净化系统的原因。 • 对空气处理，只过滤了尘粒，但还有大量微生物存 在空气中，所以采取对空气消毒的措施来消灭微生 物，例如：高温消毒的方式等杀死微生物。但是常 使用一种消毒剂会使微生物产生耐药性，因此，在 使用消毒剂时，必须定期交替使用。
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
Pi AMP ATP
1，6-二磷酸果糖
+ NH4 +
磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2
K
CO2 草酰乙酸
丙酮酸
CO2
乙酰CoA 柠檬酸
• 2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最 大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成 ）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。
•
锰缺乏时，细胞内NH4＋ 浓度高，Aa浓度高（ 蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效 应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激
这种水滴既含有尘粒污染也含有微生物污染。咳嗽一次的发菌 量为70～700个(min· 人)，喷嚏一次的发菌量为4000～60000个 (min· 人). 衣着：洁净室内当工作人员穿无菌服时，静止时的发菌量为10 ～300个/(min· 人)，躯体一般活动时的发菌量为150～1000个 (min· 人)，快步行走时的发菌量为900～2500个(min· 人) 化妆品和珠宝手饰：发胶、气雾除臭剂、眼脸膏、香粉等，为 微生物污染提供了极好的源泉。耳环、戒指、项链、手链等首 饰，因为它们难于清洗，所以可能成为感染源或污染源。 生产过程中的人为差错：当员工没有按照SOP进行工作时， 车间的污染程度增加。
T C A
淀粉
葡萄糖
6-磷酸果糖
1，6-二磷酸果糖 磷酸丙糖 磷酸烯醇丙酮酸 CO2 乙酰CoA 柠檬酸 Fe 2+ 顺乌头酸 异柠檬酸
CO2 草酰乙酸 苹果酸 富马酸
丙酮酸
CO2
琥珀酸
α-酮戊二酸
• 存在两个CO2固定系统（需Mg2＋、K＋）： • 1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作 用下，生成草酰乙酸（此作用更强）
环境卫生---属于你，属于我， 属于所有人。环境卫生 工作必须从我做起，齐心协力。
培训 形成共识
建立 无菌意识
严格检查
引入 绩效考核
厉行6Ｓ，创建安全整洁车间
分开有用物品和无 用物品，及时处理 无用物品。
有用物品须分门别类， 拿取简单，使用方便， 安全保险。
随时打扫和清理垃 圾，灰尘和污染物。
经常保持服装整洁， 环境干净。
人手洗手消毒前后手部卫生状况对比
• 洗手前：1300个/cm2 • 清水洗手后：1000个/cm2 • 肥皂洗手后：80个/ cm2 • 消毒后：0个/ cm2
未洗的手
未打皂液洗过的手
洗净的手（用洗剂）
洁净的手（消毒后）
进 入 工 作 岗 位 以 后 环境卫生是实验室、发酵工 人、消毒人员及厂区工作人 员必须时刻铭记的基本常识。
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期， 发酵液中萄葡糖含量较高，而高浓度的萄 葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的 抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸 度得到积累（注意此时积累的是酸度而不 仅是柠檬酸），但是当酸度积累到PH≤2.0 时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正 逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力 ，这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会 向后继续反应，从而达到柠檬的积累。
谢 谢！
JUST DO IT！
三、霉菌（固相与黑曲霉 大同小异）液相中菌丝形 态不同，生长条件与黑曲 霉相近，染菌后较难处理
酵母
细菌
菌种制备过程
菌源、平板涂布分离、挑选单 菌落 、单菌落小试管（6天） 、鉴定（测酸、镜检）、制作 一代小试管、一代鉴定、制作 二代茄子瓶、二代鉴定、制作 麸曲（、鉴定、储藏
单菌落挑取、单菌 落小试管、一代小 试管、二代茄子瓶
酶的抑制来实现的。
（二）TCA循环的调节
•
1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但 在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉 TCA环的第一个特点。耐酸性
•
顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件
，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺 乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是 造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。
黑曲霉柠檬酸发酵原理
主要内容
• • • • • 黑曲霉及相关知识简介 菌种制备过程 发酵底物来源 黑曲霉发酵机制 与实际生产的联系
黑曲霉简介
黑曲霉属真菌中的一个常见种，属半知菌纲。广泛分布于 世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工 业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶 、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉一般只进行无性繁殖，孢子在培养基中培养6—8h 开始萌发出芽，长出多根芽，逐步形成菌丝，菌丝不久即 出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育 细胞称为足细胞。由足细胞长出分生细胞梗，分生孢子梗 顶端包囊的聚集并原生质馍的融合，使顶端膨大形成顶囊 ，上面变生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一个 生活周期约50h。但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢 子也逐渐不断地产生，直到营养枯竭为止。