胰蛋白酶的动力学研究

实验三：胰蛋白酶的动力学研究

一.实验目的

1.掌握酶的米氏常数km值和Vmax的测定原理和方法。

2.了解底物浓度对酶促反应速率的影响。

二.实验原理

1.米氏方程：V=Vmax[S]/km+[S]

V是反应初速度，[S]是底物浓度

2.采用双倒数作图法，对1/V=km/(Vmax[S])+1/Vmax作图：

3.本实验以酪蛋白为底物，来测定胰蛋白酶的km值

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

－NH3是弱酸，完全解离时PH为11－12或更高，若用碱滴定－NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。

常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。

三.试剂与仪器

1.0.5%的胰蛋白酶溶液，用无离子水溶解。

2.酪蛋白酶溶液：40g/L，30 g/L，25 g/L，20 g/L，15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L；用稀碱溶解。

3.0.25%的酚酞溶液：2.5g酚酞用50%的酒精溶解，定容至1L。其变色范围是8.0—10.0（无色红

色）。

4.中性甲醛溶液：75ml分析纯甲醛加15ml0.25%酚酞乙醇溶液，以0.01mol/lNAOH滴定至微红，密闭

存放于棕色玻璃瓶中。

四.操作步骤

1.

组号 1 2 3 4 5 6 7 8

2.准备：7个50ml的三角瓶（分别编号：0 6），分别加入2.5ml中性甲醛与1滴酚酞（如果所取

甲醛已是微红色，则不用加碱；若不是微红色，以0.01mol/lNAOH滴定至微红色）。7瓶溶液的颜色应当一致。

3.滴定空白：按照操作1中的组号分别在0号三角瓶中加入5ml相对应的酪蛋白底物，以0.01mol/l

标准的NAOH滴定到微红色，记录消耗NAOH的体积。

4.1个200ml的碘量瓶（带磨口塞三角瓶），加40ml操作1中的组号相对应的酪蛋白底物，记为V空白，

在37℃水浴恒温锅中水浴10min，胰蛋白酶溶液也要在37℃水浴恒温锅中水浴10min。

5.10min到点后，取4ml胰蛋白酶溶液加入到酪蛋白溶液中，充分混匀，立即取出5ml反应液加入1

号三角瓶中，计时开始（0时刻）。滴入2滴酚酞，用0.01mol/lNAOH滴定至微红色，记录体积V0min。

6.按照操作5的步骤，在保温2min，4min，6min，8min，10min后，分别取反应液加入到2——6号

三角瓶中，分别滴入2滴酚酞，并用0.01mol/lNAOH滴定至微红色，分别记录体积V2min、V4min、V6min、V8min、V10min。

五.结果与分析

1.

相应图表如下：

2.酶促反应初速的的计算。

3.以1/V和1/[S]作图，延长曲线至与纵轴和横轴相关。

六.注意事项

1.取样点要准确，2min一次，动作迅速。

2.酶促反应只有10min。

3.

a)标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的

剩余氢氧化钠。

b)中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。

4.注意不要让甲醛溶液沾到手上，避免脱水。与甲醛溶液有关的一切操作均在通风橱中进行。

李彩凤

生物工程

2012/4/27