聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶temp
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g水稻种子置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
6、剥胶、染色
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比： a:b<10 脆硬乳白交联度： a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳
（三）电泳 1.安装电泳槽： 向电泳槽下槽加入 适量甘氨酸－Tris电 泳缓冲液。去掉玻 璃管下端的封口膜， 将玻璃管固定在电 泳槽上，阴极在上， 阳极在下。
2.点样： 取样品50μL，蔗糖 －溴酚篮50μL, 混匀， 加入玻璃管中。加缓 冲液至浸没过玻璃管 上端口及电泳槽上盖 的电极。排除玻璃管 下端口的气泡，连接 好电泳仪。
为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率, 通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在 分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离 胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳 开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被 浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。 它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐 色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于 H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色 的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在 的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工 酶的酶谱。
4.制备大孔胶（浓缩胶） 取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于
1:1.5:1:4的比例，分别取B液、D液和E液置 于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中， 抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小 孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。 25～35℃聚合20～30min，聚合后的大孔胶 呈乳白色。仔细吸去表面的水。
（四）染色：
临用时配制染色液：（10 ml ）
联苯胺母液
0.5 ml
H2O
9.3 ml
3% H2O2
0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过
胶条）。约10min后用自来水冲洗。
（五）记录并计算：
观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。
【要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在30～60min，聚合过 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 TEMED用量不足或已失效。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。
二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。
通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。
三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。
四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。
五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。
根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。
通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。
六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。
本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告引言：聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的生物分子分离技术，广泛应用于生物学、医学和生物化学等领域。
本实验旨在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对DNA分子进行分离和检测。
实验材料和方法：1. 实验材料：聚丙烯酰胺凝胶、TAE缓冲液、DNA样品、DNA标准品、电泳仪等。
2. 实验方法：a. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺粉末加入TAE缓冲液中，搅拌溶解并加热至溶液变清澈，冷却后倒入凝胶板中，插入梳子，等待凝胶固化。
b. 样品处理：将待检测的DNA样品和DNA标准品分别与DNA加载缓冲液混合，加热至95℃，然后冷却至室温。
c. 电泳操作：将凝胶板放入电泳槽中，加入足够的TAE缓冲液，将样品和标准品分别注入凝胶孔中，连接电源进行电泳，根据需要调节电压和时间。
d. 显色检测：电泳结束后，将凝胶取出，放入DNA染色剂中，静置片刻后，用凝胶成像系统观察和记录结果。
实验结果：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们成功地对DNA分子进行了分离和检测。
观察凝胶成像结果，我们可以看到不同大小的DNA片段在凝胶中形成了明显的带状图案。
根据DNA标准品的带状图案，我们可以估计待检测样品中的DNA片讨论和分析：1. 凝胶浓度选择：聚丙烯酰胺凝胶的浓度会影响DNA分子的迁移速率和分离效果。
较低的浓度适用于较大的DNA片段，而较高的浓度适用于较小的DNA片段。
在实验中，我们选择了适中的浓度，以获得较好的分离效果。
2. 电泳条件优化：电泳的电压和时间也会对实验结果产生影响。
过高的电压可能导致DNA片段迁移过快，难以分离；而过长的电泳时间则可能造成DNA片段过度迁移，导致结果不准确。
因此，我们需要根据实验目的和样品特点，合理选择电压和时间。
3. 结果解读：通过观察凝胶成像结果，我们可以根据DNA标准品的带状图案，对待检测样品中的DNA片段大小进行估计。
这对于研究DNA序列、检测基因突变等具有重要意义。
过氧化物酶同工酶的提取、分离
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
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4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作 为载体的一种区带电泳。
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(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具 有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
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①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－ 四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由 基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝 胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
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4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可 适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，
停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色：
将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥 下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定 液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯 胺），显色→观察记录。
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
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(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
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实验六聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、研究背景在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。
法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。
细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。
在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。
在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。
如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。
所以，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
二、实验原理1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来、以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。
因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。
这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。
本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。
这就是所谓的浓缩效应。
在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。
当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。
此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。
于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。
与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。
2、过氧化物酶同工酶的鉴定原理同工酶是来自同一生物不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构，能够催化相同反应的蛋白质。
同工酶作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序（通过RNA）直接反应了DNA链上碱基对的顺序，其变化能代表DNA分子水平上的变化，所以同工酶分析可解释为是从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的有效手段。
在生物中酶的表达直接受遗传基因的控制，酶经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。
从小麦幼苗中提取的粗酶液电泳后，进行酶的特异染色，不同的酶组分显示在凝胶的不同位置而呈现生物特有的同工酶酶谱。
3、选取小麦为样品的原理同工酶是基因的直接产物，具有明显的种属、组织和发育阶段特异性。
ＰＯＤ同工酶是植物体中常见的氧化酶，它与超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶相互协调配合，清除过剩的自由基，使植物体内的自由基维持在一个动态的正常水平，以提高植物的抗逆性。
小麦在生长发育的后期．植株趋于衰老．子粒成熟，体内自由基及其衍生物的含量不断增加．尤其是SOD氧化自由基的产物过氧化氢的增加需要大量的POD来分解过氧化氢：另一方面，生物发育后期POD活性的增加也可能用来分解叶绿素和生长素，使植株尽早停止生长．减少营养消耗，从而加强植株抵抗自由基及其衍生物和外界不良自然环境造成的伤害。
三、仪器与试剂1．实验材料: 小麦样液2．仪器（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）（2）稳压稳流直流电泳仪：北京市六一仪器厂（3）微量进样器：上海安亭微量进样器厂四、实验步骤1、电泳槽的安装将两块玻璃板（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作）正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。
安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的2％琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。
2、凝胶的制备按下表所示配制分离胶在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，小心估倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2厘米左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2~3毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿，便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。
按下表所示配制浓缩胶配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片?0.5?厘米左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。
聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。
3、点样用微量进样品小心吸取样品液加到样品槽内。
上样量：叶片样液和根部样液均以梯度上样：分别为5μl、15μl、30μl，50μl4、电泳接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电流，初始时控制在15mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到30mA左右，待前沿指示染料下行至距胶板末端1~2厘米处，即可停止电泳。
5、剥胶、染色及记录结果垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于大培养皿中，进行染色反应（样品槽可以去掉）。
过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。
染色过程如下：（1）向大培养皿中倒入约50mlpH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡6-7分钟。
（2）用漏斗回收乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，观察记录酶谱。
五、结果分析(左侧为叶，右侧为根)全模式根部电泳共出现了4条酶带，由上向下可编号为1、2、3、4，叶部电泳共出现3条酶带，与根部对比缺少3号酶带。
1、2号酶带靠近负极，3号靠近中间，4号酶带靠近正极。
分析：小麦根部的POD同工酶分子量小，形状更接近球形，主要进行脂肪的β-氧化，产生乙酰辅酶A，经乙醛酸循环，由异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，加入三羧酸循环。
小麦叶部的POD同工酶分子量较大，主要参与光呼吸作用，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢。
六、思考题1、凝胶的化学聚合与光聚合有何不同？化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED 的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
TEMED 在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。
光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。
采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。
2、两个电泳槽中的电极缓冲液用过一次后，是否可以混合后再用？为什么？不能。
因为电极缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度和pH值有关，在电泳过程中水会被电离生成氢气和氧气，两个电泳槽的电极缓冲液用过一次后，缓冲液里离子的浓度会增大，造成缓冲液的缓冲能力发生变化，离子强度过大，会影响到蛋白质的活性，使电泳速度减慢，条带不清晰。
所以不能混合后再使用。
3、样品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？①增加样品比重，使得样品能够沉到加样孔底部，而不会漂出来，防止样品扩散，从而可以使样品最大限度地跑到胶里去。
②防止细菌生长4、本实验的关键步骤有哪些？为什么？①凝胶的制备：两种胶制备完成后需立即灌胶，因为加入TEMED和过硫酸铵后，胶即刻反应，若不及时灌胶则会导致凝胶凝固不均匀，形成条带形状不规则。
覆盖水层时要轻缓，若过猛则会冲撞胶面导致分离起点不一致影响实验结果。
灌胶完毕后要立即插入梳子，否则凝胶凝固再插梳子则会毁胶。