《双水相萃取技术g》PPT课件
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《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取ppt
双水相萃取原理
• 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间 的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在 双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下 • InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc 式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。
双水相萃取技术
及其在生物医药上的应用ห้องสมุดไป่ตู้
双水相萃取技术
• • • • 双水相体系的概念与形成 双水相萃取原理 双水相萃取的技术特征 双水相萃取的工艺流程
双水相体系的概念与形成
• 传统的双水相体系是指双高聚物双水相 体系，其成相机理是由于高聚物分子的 空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形 成均一相，从而具有分离倾向，在一定 条件下即可分为二相。一般认为只要两 聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混 合时就可发生相分离，且憎水程度相差 越大，相分离的倾向也就越大。
双水相萃取原则流程
连续双水相萃取
双水相萃取技术在生物医药上的应用
1.基因工程药物的分离与提取 2.酶工程药物的分离与提取 3.抗生素的分离与提取
4.天然植物药用有效成分的分离与提取
基因工程药物的分离与提取
目的的产物在转化液中的浓度很低 ,且对温度、 酸、碱和有机溶剂较敏感 ,容易失活和变性 ,若 以常规分离手段处理 ,产品的收率较低且纯度不 高 ,而双水相萃取技术可以保证产物在温和的条 件下得以分离和纯化。其中有代表性的工作是用 PEG4000/ 磷酸盐从重组大肠杆菌(E. Coli) 碎 片中提取人生长激素(hGH) ,采用三级错流连续 萃取 ,处理是为 15L/ h ,收率达 80 %。同样 , 用 PEG8000/ Na2SO4双水相系统从重组大肠杆菌 中分离 IGF - I,收率 90 %。
生物分工程双水相萃取 66页PPT文档
(3) 回收率高 提纯倍数可达2-20倍, 如体系选择适当,回 收率可达80%-90%以上,且分离速度快。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
《双水相萃取技术》幻灯片
1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液 与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。
1956年瑞典Land大学的Albertsson教授及其同事开场 对水相系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察 了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的 分配行为，为双水相萃取系统的开展奠定了根底。 只局限于实验内的测定和理论研究。
6)与传统的高聚物双水相相比, 可更好的控制乳化现象。
3.2两水相反响器
在两水相系统中进展转化翻译功能，如酶促反响，可 以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。 这实际上是一种反响和别离耦合的过程，有时也成为萃取 生物转化；如果发生的是一种发酵过程，那么也称为萃取 发酵，因此此时也可以把两水相系统称为两水相反响器。
① 与固定床反响器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反响速度较快，生产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间外表张力低， 轻微搅拌即能姓曾高度分散系统，分散相液滴在10μm 以下，有很大的外表积，有利于底物和产物的传递。
3.5 工业设备
在萃取过程中，要求在萃取设备内两相能密切接触并伴 有较高的湍动，以实现两相之间的质量传递；此后，又能使 两相较快的别离。但是，由于两相间的密度差较小，实现两 相的密切接触和快速别离有一定的困难。
PEG/磷酸钾、PEG/磷酸胺、 PEG/硫酸钠、PEG/葡糖糖等
2.1.3 分配系数 ● 当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后， 由于各种阻碍作用的存在，物质分配不同，使其在上、 下相中的浓度不同。
K=C上/C下
C上和C下分别为被别离物质在上、下相的浓度。
• 分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各物质的K不同 ，可用双水相萃取体系对物质进展别离，其分配情况服从 分配定律。
1956年瑞典Land大学的Albertsson教授及其同事开场 对水相系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察 了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的 分配行为，为双水相萃取系统的开展奠定了根底。 只局限于实验内的测定和理论研究。
6)与传统的高聚物双水相相比, 可更好的控制乳化现象。
3.2两水相反响器
在两水相系统中进展转化翻译功能，如酶促反响，可 以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。 这实际上是一种反响和别离耦合的过程，有时也成为萃取 生物转化；如果发生的是一种发酵过程，那么也称为萃取 发酵，因此此时也可以把两水相系统称为两水相反响器。
① 与固定床反响器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反响速度较快，生产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间外表张力低， 轻微搅拌即能姓曾高度分散系统，分散相液滴在10μm 以下，有很大的外表积，有利于底物和产物的传递。
3.5 工业设备
在萃取过程中，要求在萃取设备内两相能密切接触并伴 有较高的湍动，以实现两相之间的质量传递；此后，又能使 两相较快的别离。但是，由于两相间的密度差较小，实现两 相的密切接触和快速别离有一定的困难。
PEG/磷酸钾、PEG/磷酸胺、 PEG/硫酸钠、PEG/葡糖糖等
2.1.3 分配系数 ● 当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后， 由于各种阻碍作用的存在，物质分配不同，使其在上、 下相中的浓度不同。
K=C上/C下
C上和C下分别为被别离物质在上、下相的浓度。
• 分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各物质的K不同 ，可用双水相萃取体系对物质进展别离，其分配情况服从 分配定律。
第四章 萃取-双水相萃取.ppt.Convertor
第二节双水相萃取主要内容一、概述二、物质在两相中的分配三、双水相萃取工艺流程四、双水相萃取技术的应用一、概述过滤和离心技术（取决于分离颗粒的尺寸或密度差异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质：（1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。
使将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能。
1、最早的双水相萃取现象:1896年Be jerinck，把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相（大部分明胶/大部分琼脂），聚合物的“不相溶性”。
多种不相溶的聚合物可得到多相体系。
原因？（1）聚合物的空间阻碍作用，相互间无法渗透。
（2）聚合物与无机盐可形成聚合物-盐双水相。
2、双水相萃取的优势（见表，有一系列数据说明问题）3、双水相萃取的特点：(1) 条件温和，保留产物活性；(2) 含水量高，表面张力低，耗能少(3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸等）萃取；(4) 易于放大(5) 影响因素复杂；(6) 成本高4、两水相体系形成聚合物混合时，是分层或成一相，取决于两种因素：一是体系熵增加，表明系统混沌程度的量，与分子数量有关；二是分子间作用力，与分子量有关，分子量越大，分间作用力也越大。
分子之间作用力：（1）A-A >A-B 相分离（2）A-A<A-B 混合（3）A-B>>A-A凝聚复合5、两水相体系类型两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）6、相图（见课件中图）理解：双结线(TKB)；；结点(T/B)；临界点(K)；系线(TB)上相（T，轻相）；下相（B，重相）当M点下移时，系线长度缩短，两相差别减小，到K点时，系线长度为0，两相差别消失而成为一相。
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
两种亲水性聚合物混合
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
1 混合熵的增加 —自发进行—分子的数目 2 分子间作用力 —分子间各基团相互作用之
和——分子的大小 • 对大分子而言，由于相对分子质量较大，
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
A、双水相体系同生物转化相结合：
B、双水相萃取同膜分离技术相结合： C、双水相萃取同亲和层析相结合——亲和
萃取（亲和分配）：
亲和分
配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大，为了提高分
配系数和萃取效率，可将亲和层析与两水相萃取结合起来，成 为亲和萃取或亲和分配，即把一种配基与一种成相聚合物以共 价相结合，使该配基随成相聚合物分配在某一相中。配基可也 是酶的底物，抑制剂，抗体，受体或染料等，对目标蛋白质有 很强的生物亲和力，因而使后者倾向于分配在配基—聚合物的 相中。 通常选择在PEG上接上配基，当配基—PEG的浓度增加时，蛋 白质的分配系数也增加。当蛋白质的结合位点都为配基所占据 时，即达到饱和，蛋白质的分配系数达到极大值。
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
• 操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到 平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配 系数的值重演性很好，故可直接放大
双水相萃取课件
双水相萃取的原理
根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但 分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增 大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对
分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，
即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当
越广泛。
目前，双水相萃取技术已用于多种生物体、生
物组织以及大分子生物物质的分离与纯化，并取
得了较好地成效。
1、双水相萃取常用设备
双水相萃取的基本过程包括双水相的形成、溶 质在双水相中的分配和双水相的分离。 相混合设备 静态混合器是常用的相混合设备。
相分离设备
在双水相系统中，虽然两相较容易达到平衡， 但两相分离则比较困难，这是因为两相的密度差 小，且粘度较大。 达到分配平衡的两相进行分离时，采用重力沉 降法或离心沉降法。一般用离心沉降法。常用的 离心沉降设备有管式离心机和碟片式离心机。
双 水 相 萃 取
主要内容
双水相萃取及萃取的设备工艺流程
1 2 双水相体系的形成 相图 双水相中的分配平衡
3
4 影响双水相分配系数的主要因素
有机溶剂萃取的不足: 1.许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机剂 ；
2.蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定 条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多 相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物 质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务
1）表面自由能的影响（大分子物质表面性质对K 影响很大） 2）表面电荷的影响（盐效应：两相系统中存在如 盐，对K影响很大） 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难 ，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数
生化工程下游技术知识课件第七章双水相萃取技术知识
其他领域的应用
01
02
03
环境治理
双水相萃取技术可用于处 理废水、废气等环境污染 问题，实现环境治理和资 源化利用。
食品加工
双水相萃取技术可用于提 取和纯化食品中的营养成 分，提高食品的营养价值 和品质。
化学工业
双水相萃取技术可用于分 离和纯化有机化合物、金 属离子等，促进化学工业 的发展。
04 双水相萃取技术的挑战与 解决方案
相分离困难
总结词
双水相萃取技术中，相分离困难是一个常见问题，主要表现在两相间界面不清、相分离速度慢、分离 不完全等方面。
详细描述
由于双水相萃取技术涉及的物质较为复杂，相间界面张力较小，导致两相间界面不清，容易产生乳化 现象。此外，由于物质在两相中的分配系数差异较小，相分离速度慢，有时甚至出现分离不完全的情 况。
产物稳定性问题
总结词
双水相萃取技术中，产物稳定性问题主要表现在产物在双水相中的稳定性差，容易发生 降解或聚合等现象。
详细描述
由于双水相萃取过程中涉及的物质种类较多，有些产物在双水相中的稳定性较差，容易 受到温度、pH值、金属离子等因素的影响而发生降解或聚合等现象，从而影响产物的
质量和产量。
技术成本问题
总结词
双水相萃取技术的成本较高，主要表现 在设备投资大、操作复杂、能耗高等方 面。
VS
详细描述
双水相萃取技术需要特殊的设备，如分相 器、混合器等，这些设备的投资较大。此 外，双水相萃取技术的操作过程较为复杂 ，需要严格控制温度、pH值等参数，因 此操作成本较高。同时，该技术还需要大 量的水和能源，导致能耗较高，进一步增 加了生产成本。
原理
利用生物分子在双水相体系中不同的分配系数实现分离。分配系数是指生物分 子在两相间的分配平衡时，分子在某一相中的浓度与分子在另一相中的浓度的 比值。
双水相萃取实验课件
6
SUCCESS
THANK YOU
2019/9/19
生化物质分离纯化基础实验
二. 操作方法
（一）蛋白质在两相中的分配：
10ml刻度 离心试管
加(NH4)2SO4 固体1.30克
加PEG400 2.00克
加入糖化酶 2.00ml
加水
振摇混和 (固体溶解)
离心 3000转/分
5min
求蛋白质分配系数
数____g__℃ ml
累计量 g 计总量
g
g
PEG (NH4)温2SO度4 =
%(g/g) %(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同
标准曲线图： OD OD = K · μg ＋ b 求斜率K和截距b
μg
上相
C上
OD b K
100
g / ml
下相
OD b 1
C下
K
0.1
g / ml
11
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全 部溶解，原因是什么？
二. 选择正确的离心操作顺序: 1. 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放 在离心机中。 2. 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
二. 相图的制作方法
(一) 溶液配制
配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称硫酸胺 215.0g
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2019/9/19
生化物质分离纯化基础实验
二. 操作方法
（一）蛋白质在两相中的分配：
10ml刻度 离心试管
加(NH4)2SO4 固体1.30克
加PEG400 2.00克
加入糖化酶 2.00ml
加水
振摇混和 (固体溶解)
离心 3000转/分
5min
求蛋白质分配系数
数____g__℃ ml
累计量 g 计总量
g
g
PEG (NH4)温2SO度4 =
%(g/g) %(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
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生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同
标准曲线图： OD OD = K · μg ＋ b 求斜率K和截距b
μg
上相
C上
OD b K
100
g / ml
下相
OD b 1
C下
K
0.1
g / ml
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生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全 部溶解，原因是什么？
二. 选择正确的离心操作顺序: 1. 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放 在离心机中。 2. 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
二. 相图的制作方法
(一) 溶液配制
配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称硫酸胺 215.0g
《两水相萃取法》PPT课件
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当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别 减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
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双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
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三、分配理论
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如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
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如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
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如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进 行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。
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（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。
大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
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（六）、荷电PEG作为成相聚合物
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1.2.2 疏水作用
PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水 性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点 处的分配系数maa测算
l酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。所以上式中 B为
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
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a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和精P选EpGpt/磷酸钾(KPi)系统的典型相图 6
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似 服从杠杆规则，即
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖 (dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采 用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富 含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
双水相萃取技术
1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用
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1.1 双水相系统
• 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需 经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的 活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并 且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采 用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法 可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
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实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电
解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系 数≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的 分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论 推导溶质的分配系数表达式为
lnm=lnmo+FZ/RT
因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正 比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同， 故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异.
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双水相体系
物质类型
两种非离子型聚合 物
物质P的名称 聚丙二醇
物质Q的名称
聚乙二醇 聚乙烯醇
葡聚糖（Dx） 羟丙基葡萄糖
聚乙二醇（PEG）
P为带电荷聚电解质
P Q都为聚电解质 P为聚合物 Q为盐类
硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐
羧甲基葡聚糖钠盐 聚乙二醇
聚乙烯醇 葡萄糖 (Dx) 聚乙烯吡咯烷酮
PEG/Dx,pH=pI;NaCl(mol/kg): (○) 0; (□) 0.6; (●) 1; (△) 2
表示
lnm0=HF× HFS
从实验结果可知,蛋白质的表面疏水性HFS随添加 NaCl浓度的增大而增大.将盐对蛋白质疏水性的影 响引入上式，则
lnm0=HF( HFS+ △HFS)
式中， △HFS为盐浓度增加引起的HFS值增量。因此：
lnm=HF(HFS+HFS)+ FZ/RT
盐浓度对血红蛋白分配系数的影响
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
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1.2 双水相中的分配平衡
与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系 数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1 和c2分 别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。
B = lnmGly/HF
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pH＝pI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系， 直线的斜率就是该双水相系统的HF值。
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如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0) 与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质
的表面疏水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系 统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏 水作用和生物亲和作用等。
lnm=lnme+lnmh+lnml
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1.2.1 静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响， 利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：
lnm = -Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和
成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间 呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不同 溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一 溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因 为式中的λ随双水相系统而异。
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聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高 分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对 分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过 程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的 周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平 衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种 含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合 物的不相容性。
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有机溶剂萃取的不足：
➢ 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂; ➢ 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
双水相萃取的优点:
① 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成； ② 适合热敏物质的提取，主要是胞内酶； ③ 亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水
分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白质在 两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。