水稻原生质体制备
水稻原生质体培养及其进展
番 茄根 部 分离 出大 量 有 活 力 的 原 生 质体 后 才使 原 生
用 蒸 馏 水 浸 泡 并置 于 5 0 ℃ 下保 温
。
小 时 接 种于
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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质体 培 养及 其应 用 的研 究 突 飞 猛 进 成果
,
近 二 十年的研 究
培 养 基 上 经 作 者 多 次试 验 表 明 用 此 法 处理 虽 然 使 萌 发和 出 愈较 其 方 法 晚
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体 的一 个崭新 时代
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细 胞 工 程 则是 其 中最 为 重 要 最 为
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片 细 胞 的迅 速 分 裂 最后 形 成淡 黄 色 质 地 致 密 的 胚 生
) 水 稻 的幼 穗 由于 外 部 叶 片 的 紧密 包 围 愈 伤组 织 川 ( 2
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目 前 细 胞 工 程 可 分为 组 织培 养 原 生 质
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[ 〕突破 了水 稻 原 生 l 原 生 质体 再 生 出成 熟 的梗稻 植株 ’
细 胞力变 得较 紧密 细胞小 而 质 浓 这类 细 胞 游 离 出 的
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质体 培 养 这 一 禁 区
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水稻原生质体提取及转化
十四、水稻原生质体提取及转化1.将水稻种子去壳后，用70%酒精清洗30 sec，再用30% 次氯酸钠溶液浸泡30 min。
2.将消毒过的水稻种子植于1/2 MS培养基中，避光培养12-14天后，得到的黄化苗可进行原生质体提取。
3.现配20 mL enzyme solution并置于5 公分塑料培养皿中。
4.取黄化苗水稻茎部用锋利刀片细切至0.1-0.5 mm置于enzyme solution中。
5.将含有水稻材料的enzyme solution 抽气15-20 cm-Hg，15-30 min。
6.28℃，40 rpm持续震荡3 hr。
7.28℃，80 rpm继续震荡30 min。
8.用300目尼龙网布过滤含有原生质体的enzyme solution，将过滤的enzymesolution 250g离心3 min。
9.去除上清液，小心用W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
10.再次用250g离心1 min。
11.去除上清液，加入W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
12.原生质体置于冰上30 min后可进行PEG转化。
13.30 min 稍微离心去除上清液，加入MMg solution 使原生质体总数为2-5×105。
14.取5-10 μg Plasmid DNA 体积为20μL，加入200μL 原生质体，置于冰上10 min。
15.加入等体积PEG4000溶液，小心混匀并置于室温下15 min。
16.加入1 mL W5稀释并终止反应，100g离心2 min。
17.去除含有PEG4000的上清液，加入W5或Incubation Solution重新悬浮并置于用0.1% BSA浸泡过的塑料培养皿中培养。
18.原生质体在28℃，40rpm 暗培养12-16 hr后用激光共聚焦显微镜观察。
试剂配方：Enzyme solutionCellulase RS (Yakult)2%macerozyme R10 (Yakult)1%MES pH5.60.1%mannitol (fresh prepare)0.4 MHeat 55℃,10 min and cool at RTCaCl2.2H2O 0.1%0.45 μm Filter sterilizedW5 SolutionWorking Stock Add154 mM NaCl 3 M 10.3 mL125 mM CaCl2 1 M 25 mL5 mM KCl 0.2 M 5 mL2 mM MES (pH5.7) 0.1 M 4 mL5 mM glucose 0.1 M 10 mLAdd H2O final to 20 mLMMg SolutionWorking Stock Add0.4 M mannitol (fresh) 0.8 M 7.5 mL15 mM MgCl2 1 M 0.15 mLAdd H2O final to 200 mLPEG Solution (40%,V/V)Stock Final concentration PEG 4000 (Fluka,81240) 4 g 40%0.8 M mannitol 1.093 g 0.6 M1 M CaCl2 1 mL 0.1 MAdd H2O Final to 10 mL将PEG solution 与55 ℃水浴溶解，冷却后可进行转化Incubation Solution (10 mL)Working Stock Add0.6 M mannitol 0.8 M 7.5 mL4 mM MES pH5.7 0.1 M 0.4 mL4 mM KCl 0.2 M 0.2 mLAdd H2O 1.9 mL。
水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)原生质体制备与再生技术及优化
水 稻 纹枯 病 菌 （ Ｒ ｈ ｉ ｚ ｏ ｃ ｔ ｏ ｎ ｉ ａ ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ｉ ） 原 生质体 制 备与再 生 技术及 优化
孔丹 丹 ，阙亚伟 ，闫霞 ，李亚 ，陈卫 良，王政逸
（ 浙 江 大 学 生 物 技 术研 究 所 ， 杭州 ３ １ ０ ０ ５ ８ ）
摘 要 水稻 纹枯 病 的 病 原 茵是 立 枯 丝 核 茵 （ Ｒｈ ｉ ｚ ｏ ｃ ｔ ｏ ｎ ｉ ａ ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ｉ Ｋｔ ｉ ｈ ｎ ） ， 其病原茵（ Ｒ ．ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ｉ Ｋｉ ｉ ｈ ｎ ） 又 称 为 水 稻 纹 枯 病（ ｒ ｉ ｃ ｅ ｓ ｈ ｅ ａ ｔ ｈ ｂ ｌ ｉ ｇ ｈ ｔ ） 茵， 由立 枯 丝核 茵侵 染 引起 的 水稻 纹 枯 病 是 水稻 上 最 重 要 的病 害之 一 ． 为 建 立 高 效 的 水 稻 纹 枯 病 菌 原 生 质体 制 备 技 术 体 系 ， 采用０ ． ７ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｎａ Ｃ ｌ 作为渗透 稳定剂 ， 对 Ｇｌ ｕ ｃ ａ ｎ ｅ ｘ 、 溶壁 酶（ １ ｙ ｗａ ｌ ｌ ｚ ｙ ｍｅ ） 、 纤 维 素
ＫＯＮＧ Ｄａ ｎ ｄ ａ ｎ，ＱＵＥ Ｙａ ｗｅ ｉ ，ＹＡＮ Ｘｉ ａ ，ＬＩ Ｙａ ，ＣＨＥＮ Ｗｅ ｉ ｌ ｉ ａ ｎ ｇ ，Ｗ ＡＮＧ Ｚ ｈ ｅ ｎ ｇ ｙ ｉ （ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｂｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｚｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｈａ ｎ ｇｚ ｈ ｏ ｕ ３ １ ０ ０ ５ ８ ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ）
ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｓ ． ｚ ｊ ｕ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ ／ ａ ｇ ｒ Ｅ — ｍａ ｌ ： ｚ ｄ ｘ ｂ ｎ ｓ ｂ ＠ｚ ｊ ｕ ． ｅ ｄ ｕ． ｃ ｎ ＤＯＩ ： １ ０． ３ ７ ８ ５ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８—９ ２ ０ ９ ． ２ ０ １ ２ ． ０ ８ ． ０ ７ １
水稻原生质体转化
水稻的培养: 水稻去壳后于75%的酒精中浸泡1 min，再用50%的次氯酸钠消毒30 min后，分别播种到1/2MS培养基培养基上，1.2.5 水稻原生质体转化实验水稻原生质体转化实验参照文献（Bart et al., 2006），具体做法如下:（1）水稻黄化苗培养。
将水稻种子（约100粒）去壳后消毒（参见上文），播种到1/2MS培养基上，黑暗条件下，28℃培养12 d。
（2）黄化苗的处理。
去除黄化苗的根和叶，将其茎切成1～2 mm的小段，放入含有15 mL酶解液的培养皿中。
（3）酶解液浸润水稻组织。
将培养皿盖打开，室温条件下,避光抽真空1 h，使酶解液浸润组织。
（4）酶解组织，释放细胞。
盖好培养皿盖，避光，25℃，40 rpm酶解组织4 h。
随后将转速调至80 rpm，释放细胞2 min。
（5）收集细胞。
向培养皿中加入等体积的W5溶液，轻轻混匀，经Miracloth 和millipore过滤组织残渣，并用2倍酶解液体积的W5溶液洗组织残渣3次，1500 rpm离心4 min，小心弃上清；加入10 mL W5溶液重悬细胞，1500 rpm离心4 min，小心弃上清。
（6）重悬细胞，确定细胞浓度。
加入一定体积的MMG溶液重悬细胞，用血球计数板确定细胞浓度，当细胞浓度达到106个/mL时即可用于原生质体转化。
（7）原生质体转化。
在2 mL的离心管中，按照表3加入相应的质粒DNA，200 uL的细胞悬浮液，220 uL的40% PEG，轻轻混匀，于25℃避光条件下孵育20 min。
加入1 mL的W5，轻轻混匀，终止反应，置于25℃培养箱中避光培养12 h。
（8）细胞裂解。
从培养箱中取出细胞悬浮液，2000 rpm离心5 min，弃上清。
加入200 ul的1×CCLR，涡旋振荡30 s后，2000 rpm离心5 min。
水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化
水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化杨迎青;李明海;杨媚;李勇;周而勋【期刊名称】《华中农业大学学报》【年(卷),期】2010(29)5【摘要】为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。
结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。
【总页数】6页(P546-551)【关键词】水稻纹枯病菌;原生质体;制备;再生【作者】杨迎青;李明海;杨媚;李勇;周而勋【作者单位】华南农业大学资源环境学院【正文语种】中文【中图分类】S435.111.42【相关文献】1.水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）原生质体制备与再生技术及优化 [J], 孔丹丹;阙亚伟;闫霞;李亚;陈卫良;王政逸2.烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化 [J], 高雪艳;储巧玲;周凌峰;韩国民3.截短侧耳素产生菌原生质体的制备条件优化及再生 [J], 都雯玥;王鸣刚;梁剑平;陆锡宏;李雪虎4.猴头菌融合育种原生质体制备与再生条件优化 [J], 杨珊;张赫男;李巧珍;吴迪;陈明杰;杨焱5.柄蓝状菌原生质体的制备与再生条件优化 [J], 张荟蓉;周志义;耿安利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用
水稻是一种重要的农作物，而提取其茎单细胞原生质体是一项重要的研究内容。
茎单细胞原生质体是一个包含丰富细胞器的细胞成分，具有多种应用潜力。
本文将就一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用进行深入探讨。
1. 概述水稻是世界上重要的粮食作物之一，对于提高水稻的产量和抗性具有重要的意义。
茎单细胞原生质体是细胞内部的重要成分，它包含了细胞膜、细胞器和细胞质等多种重要物质，对于研究水稻的生长、代谢和抗性具有重要的作用。
2. 提取方法提取水稻茎单细胞原生质体是一项复杂的工作，需要一定的技术和设备支持。
一种常用的提取方法是采用酶解法，首先将水稻茎组织研磨成细胞悬浮液，然后加入葡萄糖酶等酶解剂，经过一定的时间和温度处理后，通过差速离心等手段，最终可以得到茎单细胞原生质体。
3. 应用价值水稻茎单细胞原生质体的提取具有重要的应用价值，首先可以通过光学显微镜观察到细胞膜、叶绿体、线粒体等重要细胞器的形态和结构，这对于研究水稻的生长和发育具有重要的作用。
可以通过分离和纯化细胞膜，进行生化分析和功能研究，探索水稻抗病、抗逆性等重要生理机制。
另外，还可以通过提取细胞中的核酸、蛋白质等重要分子，开展分子生物学研究，如基因的克隆、表达和功能分析等。
4. 个人观点水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用是一个重要的研究方向，它对于水稻的生长、代谢和抗性具有重要的意义。
在今后的研究中，我认为可以进一步优化提取方法，提高提取效率和纯度；可以开展更多的应用研究，如利用蛋白组学和基因组学技术，揭示茎单细胞原生质体在水稻抗逆性等方面的重要作用。
总结回顾水稻茎单细胞原生质体的提取是一个重要的研究内容，它对于水稻的生长、代谢和抗性具有重要的作用。
尽管目前的提取方法已经具有一定的成熟度，但在今后的研究中仍然需要不断的优化，以更好地满足研究的需求。
对于茎单细胞原生质体的应用研究也需要不断深化，以揭示其在水稻生理过程中的重要作用。
通过本文的探讨，相信读者对水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用有了更深入的了解。
黄化苗文献综述
黄化苗文献综述黄化苗是一种以黄色为主色调的观赏植物，含有多种色素，赋予了它鲜艳的颜色。
在生长过程中，如果环境中有过量的干扰素、病毒、病菌等，会导致水稻出现黄化症状。
黄化苗的黄化症状是由于叶绿素含量下降和类胡萝卜素含量增加，导致氯黄色素积聚在叶片内部形成。
选取7-10天生长的黄化苗，浸泡在细菌素和酶解液混合液中，然后放到振动培养箱中，进行振动培养，使其细胞质体充分释放。
过滤细胞悬液，去除细胞膜，细胞核等杂质。
再用不同的离心速度分离出不同的组分。
水稻原生质体的制备选择黄化苗作为优质材料的原因在于，黄化苗相比于正常的苗期生长受到了一定的抑制和干扰，使得其细胞质中含有更多的植物生长素和细胞分裂素。
这种差异性质可以为原生质体的制备提供优质的材料。
黄化苗含有丰富的类黄酮，包括芸香黄素、异酮路芪素、芍药苷等。
这些成分不仅可以增加黄化苗的色彩饱和度和留存时间，还具有较强的抗氧化性和抗炎作用。
此外，它还含有叶黄素，这是一种天然的类胡萝卜素，是植物生长过程中必不可少的营养物质。
叶黄素可以保护植物组织，吸收紫外线，从而防止紫外线对植物组织的损伤。
黄化苗是一种具有观赏性和营养价值的植物，其独特的黄色色调和丰富的色素成分可以作为植物育种和农业生产的优质材料。
同时，对于水稻原生质体的制备来说，黄化苗是一种优质的制备材料，可以通过对其色素和营养物质的提取和分析，进一步了解其生理特性和生态价值。
黄化苗在育种领域有多个应用：1.提高作物抗病性：黄化苗的基因型和抗病性之间存在一定的关联，因此可以通过黄化苗的筛选和培育，提高作物的抗病性，如番茄、茄子、辣椒、黄瓜、西瓜、甜瓜、烟草等作物。
2.辅助作物育种：黄化苗的出现与植物体内叶绿素含量下降和类胡萝卜素含量增加有关。
这种变化使得黄化苗的叶片呈现黄色，与正常植株的绿色叶片形成鲜明对比。
这为育种工作者提供了直观的筛选条件，可以快速地发现并选择具有优良性状的黄化苗，如抗病性强、产量高等。
3.提取和生产天然色素：黄化植物中所含的一些次生代谢产物具有显著的抗氧化活性和抗菌作用，可以用于食品添加剂，提高食品的质量和保鲜期。
水稻原生质体分离与转化方法2014-01-20
水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。
现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。
本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。
一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。
或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。
注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。
制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。
2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。
通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。
质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。
二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。
50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。
溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2?2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。
2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
实验三 原生质体
. 重复上一步。 重复上一步。
. 从此，室温进行，每管沉淀用 从此，室温进行，每管沉淀用450µl MMG 重悬
5. 取25~50µg质粒于1.5ml离心管中，加100µl上一 质粒于1.5ml离心管中 离心管中， 质粒于 上一 步重悬过的细胞， 剪头200µl枪头轻轻吹匀。 枪头轻轻吹匀 步重悬过的细胞，用剪头 枪头轻轻吹匀。
.柱子加入空 管，向膜中加入 柱子加入空EP管 向膜中加入30µl Elution Buffer,室 柱子加入空 室 置2min
观察原生质体•源自下午观察上午制备的原生质体细胞， 下午观察上午制备的原生质体细胞， 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 静置后下层的细胞 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 制片， 制片，观察
1. 原生质体的制备
实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞 天的水稻悬浮细胞, 实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞, 20ml 实验试剂： 实验试剂：20ml
100ml 0.147g 纤维素酶RS NaOAc 甘露醇 pH 5.7 0.098g 离析酶R－10 11g 20ml 0.24g 0.12g
第二天，周六，3.17，地点实验楼，626 第二天，周六， ，地点实验楼， 1- 5 组观察 上午 9:00 10:00 6-10 组观察 10
实验目的 • 掌握水稻原生质体的制备方法； 掌握水稻原生质体的制备方法； • 掌握基因瞬时转化方法； 掌握基因瞬时转化方法； • 了解 了解GFP的发光原理； 的发光原理； 的发光原理 • 了解质膜蛋白的分选途径。 了解质膜蛋白的分选途径。
尽管450～490nm(蓝光)是 是GFP的副吸收峰,但由于长波 能量低,细胞忍受能力强, ,因此更适合于活体检测.
3、水稻悬浮细胞原生质体转化 水稻悬浮细胞原生质体转化
稻瘟病菌原生质体制备条件优化实验研究(精)
稻瘟病菌原生质体制备条件优化实验研究尹良芬 1,2, 八重樫博志 3(1. 华中农业大学植物科技学院 , 湖北武汉 430070; 2. 湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室 ,湖北武汉 430070; 3. 日本佐贺大学农学部 , 日本佐贺县 840-8502 摘要 :原生质体的制备一直是现代分子生物学研究的重要内容。
以稻瘟病菌作为供试菌株 , 优化了其原生质体的制备条件。
优化的原生质体制备条件包括 :使用新鲜的菌丝进行接种 ; 加入玻璃珠一起培养 , 通过振荡使菌丝体破碎分离以获得更多的生长点 ; 菌悬液继续加入新鲜培养液进行培养 ; 原生质体沉淀时选择 3 000r /m i n 离心 10m i n, 保证最大限度地收集原生质体。
实验证明 , 通过这 4个条件优化后 , 原生质体的产量有了极大的提高 , 每毫升酶液可制备 10 8~109个原生质体。
关键词 :原生质体制备 ; 稻瘟病菌 ; 原生质体产量中图分类号 :Q 813. 2; Q 949. 32文献标志码 :B 文章编号 :1002-4956(2011 04-0033-03O p t i m i z i n gp r o c e s s o f p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n i n M a g n a p o r t h e o r y z a e Y i n L i a n g f e n 1,2, Y a e ga s h i H i r o s h i 3(1. C o l l e g e o f P l a n t S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , H ua z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 2. K e y L ab o r a t o r y o f C r o p D i s e a s e M o n i t o r i n g a n dS a f e t yC o n t r o l i n H u b e i , H u a z h o n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , W u h a n 430070, C h i n a ; 3. F a c u l t yo f A g r i c u l t u r e , S a g a U n i v e r s i t y , S a g a 840-8502, J a pa n Ab s t r ac t :P r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n i s a n i m p o r t a n t s t ud y i n m o de r n m o l e c u l a r b i o l o g y . S e v e r a l c o n d i t i o n s i n p r e -p a r i n g t h e p r o t o p l a s t s of M ag n a p o r th e o r y z a e w e r e o p ti m i z e d . T h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s i n c l u d e d u s i n g f r e s h m y c e l i a o f M a g n a p o r t h e o r y z a e s t r a i n s t o i n o c u l a t e a d d i n g g l a s s b e a d s (10m m i n d i a m e t e r i n l i q u i d m e d i u m w h i l e i n c u b a t i n g , a n d s h a k i n g v i g o r o u s l y e v e r y 4ht o e n c o u r a g e u n i f o r m g r o w t h o f m y c e l i u m. T h e c u l t u r e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o p e t r i d i s h e s w i t h f r e s h l i q u i d m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 30℃ f o r o n e d a y . P r o t o p l a s t s w e r e d e p o s t i o n b y c e n t r i f u g a t i n ga t 3 000r /m i n f o r 10m i n , t h i s s p e e d c o u l d d e c r e a s e t h e l o s s o f p r o t o p l a s t s m o s t l y . A f t e r t h e s e f o u r c o n d i t i o n s o p t i m i z e d , p r o t o p l a s t s w e r e e a s i l yo b t a i n e d a t a b o u t 108~109m L -1. K e yw o r d s :p r o t o p l a s t p r e p a r a t i o n ; m a g n a p o r t h e o r y z a e ; p r o t o p l a s t y i e l d 收稿日期 :2010-06-28基金项目 :日本教育、文化、体育、科学技术省 (文部省基金项目(11660050 作者简介 :尹良芬 (1974— , 女 , 云南罗平 , 硕士 , 实验技术员 . E -m a il :y i n f a n g l u o yi @g m a i l . c o m 原生质是有组织的生活物质 ,是细胞生命活动的物质基础。
水稻原生质体制备及转化实验方法
单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。
放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。
使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。
40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
水稻原生质体制备条件的优化及其细胞壁变化的快速检测
水稻原生质体制备条件的优化及其细胞壁变化的快速检测柳琳;陈越;钟巧芳;余腾琼;柯学;程在全【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2014(023)009【摘要】以疣粒野生稻和栽培稻02428的成熟种子为材料,对愈伤组织的诱导和继代、胚性悬浮细胞系建立、原生质体制备、再生细胞团分化及植株再生进行研究.结果表明:(1)水稻愈伤组织诱导的最佳2,4D浓度为0.014 mmol/L;(2)胚性悬浮细胞系建立的最佳条件为AA悬浮培养基+0.009 mmol/L 2,4D,每25 mL液体培养基加入0.4g愈伤组织的初始接种量,7d的继代周期;(3)原生质体制备的最佳条件为20 g/L纤维素酶+ 1g/L果胶酶,酶解5h,800 r/min离心5 min;(4)用荧光增白剂(VBL)细胞壁染色液可以快速、准确的检测原生质体制备及培养过程中细胞壁的变化情况.【总页数】7页(P56-62)【作者】柳琳;陈越;钟巧芳;余腾琼;柯学;程在全【作者单位】云南大学,昆明 650091;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明 650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明650223;云南省农业生物技术重点实验室,昆明 650223;云南昆明农业部西南作物资源与新种质创制重点实验室,昆明 650223【正文语种】中文【中图分类】Q24;S511【相关文献】1.基于 VBL 增白剂细胞染色的水稻原生质体细胞壁变化检测 [J], 柳琳;陈越;陈玲;李维蛟;程在全2.枯草杆菌原生质体再生前后细胞壁的变化及其... [J], 王忠彦;孙启玲3.响应面法优化玉木耳原生质体制备条件 [J], 苏文英; 杨和川; 谭一罗; 周振玲; 秦裕营; 李晓4.响应面法优化玉木耳原生质体制备条件 [J], 苏文英; 杨和川; 谭一罗; 周振玲; 秦裕营; 李晓5.基于蛹虫草单核芽生孢子的原生质体制备条件的优化 [J], 娄海伟;余颖豪;林俊芳;郭丽琼;叶志伟;李艳;魏韬;云帆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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试剂：
1、酶解液
0.6M mannitol（182.17）：
10mM MES, PH5.7
1.5% Cellulase RS
0.75% Macerozyme
备：65度加热10
然后加入：
0.1%BSA
3.4mMCaCl2-2H2O
5mM β-巯基乙醇
50ug/ml 羧苄青霉素carbenicillin
2、W5溶液
154mM NaCl,
125mM CaCl2,
5mM KCl,
2mM MES (pH 5.7)
3、Mmg solution
(0.6M mannitol, 15mM MgCl2, 4mM MES (pH 5.7) 4、incubation solution
(0.6 M mannitol, 4mM MES (pH 5.7), 4mM KCl) 5、40% PEG
(0.6M mannitol, 100mM CaCl2, 40% v/v PEG4000)
母液：1.2M mannitol：50ml（10.93g，定容于50ml）1M MES，ph5.7：
切叶片
抽真空（15Hg）
760毫米汞柱高是一个大气压；
酶消化4小时，28度，黑暗，转速50rpm
完毕后，镜检；黄花苗的protoplasts 由于中部有个大液泡，所以对焦后才能见。
需要多的protoplasts, 可以加摇几个小时，镜检，满意为止。
过滤：
35um （100mu）过滤，这时候要gentle with proplasts。
离心：
150g 5分钟，收集proplasts。
然后加入W5，等体积。
W5：150mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl, 2mM MES(PH5.7) , 然后，1500rpm（本实验室的离心机相当于289g or 289rcf Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数g为重力加速度(9.80665m/s2)），5分钟。
这后，看到原生体小团在离心管底部。
小心倒掉上清。
每次去上清都会损失一部分protoplasts
重悬protoplasts：
加入1ml W5，转移到2ml离心管。
离心3分钟，150g。
重悬：Mmg溶液（0.6M mannitol，15mM MgCl2，4mM MES（PH7.5）加多少取决于，达到1ul内有1000个cell 至少）
PEG 介导的转化：
1、100ul protoplasts 和25ug 质粒DNA。
2、加入110ul 40% PEG （0.6M mannitol，100mM CaCl2，40% v/v PEG4000），温柔混匀，可以用枪头缓慢吹吸
3、28度孵育15分钟。
然后加入至少10 倍体积的volumes of W5. 目的是稀释PEG，使得原生质体很好的成团
4、离心150g，3分钟，去掉上清，然后洗一次用W5
5、第二次洗完，用适当的孵育液（50-100ul）(0.6 M mannitol, 4mM MES (pH 5.7), 4mM KCl) 重悬。
镜检。
6、黑暗28度，16小时。