蛋白表达纯化实验步骤
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白纯化步骤
蛋白纯化步骤引言：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。
为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。
一、细胞裂解和收集蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。
常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。
裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。
二、沉淀和上清液分离细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。
常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。
这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。
三、蛋白质分子量筛选蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。
这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。
常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。
亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。
通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。
五、离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。
根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。
通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。
六、凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。
通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。
这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。
七、逆流层析逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。
该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。
通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
蛋白质的表达纯化
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白：用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白：用10mL洗脱缓冲液洗柱，每管0.5－1 mL， 共收集6－10管，分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 （含100ug/mL 氨苄 青霉素），37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉 素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3．制浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶，配
方如下：
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis
MBP 蛋白纯化
1 诱导
预表达
5mlLB+100μL菌，37℃摇到OD=0.4~0.6（约2到3小时）；
加IPTG(1M IPTG一般2.5μL，可多设几个浓度)；
取样0h,2h,4h,6h,过夜；每次1ml
离心菌液，加20μL loading，沸水煮，跑胶检测
大量表达后菌液处理
12000rpm，2min,4℃,收集菌体；
CB洗1~2两次，10000 rpm，2min,4℃，
加CB重悬（100ML菌液一般2ML，可根据自己菌的多少和所需蛋白的浓度改变）；
然后超声或者冻融：
10000 rpm，20min,4℃，上清就是你要的啦（如果是第一次做可留一点检测上清中是否有你的蛋白，不要全部纯化啦）
MBP 蛋白纯化
一、溶液：
CB （Column buffer）:50ml
配方：
1M Tris-HCl pH 7.4 1ml
NaCl 0.585g
0.5M EDTA 100ul
Elution buffer：
50ml CB + 0.158g麦芽糖
二、纯化步骤
1、200ul beads 短离心，弃上清(15s)
2、用1ml CB 重悬，洗两次10000rpm
3、重悬在200ul CB中
4、加入200ul 粗提蛋白(上清)
5、4℃混匀60min，离心1min，弃上清
6、用1ml CB 重悬洗一次。
7、加入elution buffer，4℃混匀30 min
8、离心1min，取上清。
9、重复1次。
三、回收beads
1、水3倍体积
2、0.1% SDS 3倍体积
3、水1倍体积
4、CB 3倍体积
保存在20% 乙醇，4℃.。
蛋白真核表达流程
蛋白真核表达流程
蛋白真核表达的流程包括以下步骤：
1. 克隆DNA：通过PCR等方法扩增感兴趣的基因，并将其植入真核表达载体中。
2. 转化真核细胞：将目标基因的真核表达载体转染到真核细胞中，可以使用病毒载体、电穿孔等方法。
3. 表达蛋白质：使用适当的诱导剂或激励剂（如药物）启动目标基因的转录和翻译过程，使真核细胞产生目标蛋白质。
4. 收集细胞：收集经过表达的真核细胞，可以通过离心沉淀的方式将细胞分离出来。
5. 裂解细胞：使用适当的裂解液或破壁方法将细胞裂解，释放出目标蛋白质。
6. 纯化蛋白质：根据目标蛋白质的性质进行样本处理，然后进行亲和纯化，获取目的蛋白质。
7. 检测蛋白质：使用各种检测方法（如Western blot、ELISA等）对目的
蛋白质进行检测和鉴定。
8. 表达条件优化：根据实验结果，对表达条件进行优化，提高目的蛋白质的表达量和纯度。
9. 应用研究：将纯化的目的蛋白质用于后续的应用研究，如功能研究、药物筛选等。
以上步骤仅为大致流程，具体的实验操作和技术方法可能因实验需求、目的蛋白质的性质等因素而有所不同。
(完整word版)蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total—RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA。
4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达.1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0。
6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达).2）SDS—PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3）将有表达的菌株10％甘油保种,保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60％，使用时自己计算用量。
4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140—180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1％的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1。
5，约5h左右，视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1。
0左右（约2.5h～3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。
）注：菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
简述蛋白质表达的主要操作流程
简述蛋白质表达的主要操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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目的蛋白表达与纯化protocol
目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
2、保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。
3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。
4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm 离心1min，弃尽上清，-200C保存。
160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。
大量表达：1、挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。
3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
（对照）4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C 保存。
蛋白纯化CSM-昆虫细胞中蛋白表达与纯化
14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
2、第二天，小心地挑取培养菌落中的单克隆，加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中，放在37℃的摇床中培养过夜。
3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中，于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6～0.8 之间，就可以拿出，把菌液放置于4℃冷却菌液20～30min。
4、在超净台中，加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM，诱导蛋白表达，于18℃摇床中培养6-8h。
5、诱导完成以后，8000 rpm 离心10min，沉淀收集菌体。
6、在沉淀后的细菌菌体中，加入lysis buffer（10 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mMNaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）中重悬，1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液，进行超声破碎，然后12000rpm 离心20min，离心后取上清。
7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中，于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。
8、加入4 mL 的wash buffer（300 mM NaCl，20 mM 咪唑，50 mM NaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂），在冰上洗4 次，每次孵育10min。
9、加入elution buffer（250 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，用NaOH调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）洗脱重组蛋白4 次，每次用500μl。
14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。
7、蛋白的诱导表达。
1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
动等原因，要及时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。
5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。
注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。
2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。
8、取得上清1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。
10000rpm，15min，4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。
轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。
平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。
）9、纯化上清---摸洗脱条件。
1）镍柱处理。
将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。
2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。
（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。
蛋白质表达与纯化步骤
蛋白质表达与纯化步骤一、蛋白质表达的那些事儿蛋白质表达就像是一场神奇的魔法秀，要让小小的基因变成实实在在的蛋白质呢。
咱先得从基因开始说起。
基因就像是一个藏着宝藏密码的小纸条，我们要把这个密码找出来，然后送到一个特殊的“工厂”里，这个“工厂”就是细胞啦。
在细胞这个“大工厂”里，有各种各样的“小工人”，也就是各种酶和分子机器。
我们要把基因送到细胞里，就像是把宝藏密码送到工厂里一样。
不过这可不是随随便便就能送进去的，得用一些特殊的方法，就像你要进一个很严格的地方得有通行证一样。
比如说，我们可以用一些载体，这些载体就像是小飞船，带着基因这个“乘客”进入细胞。
而且呀，不同的细胞就像不同的工厂，有的擅长生产这种蛋白质，有的擅长生产那种蛋白质。
所以我们得挑选合适的细胞。
要是选错了细胞，就可能像把做蛋糕的配方送到做鞋子的工厂一样，完全不对路嘛。
1. 基因的准备我们得先把想要表达的基因从它原来的地方给找出来。
这有时候就像在一个超级大的图书馆里找一本特定的书一样难。
我们可能得用一些特殊的工具，像是限制酶，它就像一把小剪刀，可以把基因从长长的DNA链上准确地剪下来。
然后我们还得把基因整理得干干净净的，不能有其他乱七八糟的东西混在里面，就像我们要把书擦干净，不能有灰尘一样。
2. 载体的选择载体的种类可多啦。
有质粒载体，它就像一个小小的环状“快递盒”，可以把基因装在里面。
还有病毒载体，这就更酷了，就像用一个小病毒来当快递员，不过这个病毒是经过我们改造的，不会让人生病的哦。
选择载体的时候，我们要考虑很多东西，比如这个载体能不能在我们选定的细胞里生存呀，它能装多少基因呀，就像我们选快递盒的时候要考虑大小和能不能送到目的地一样。
二、蛋白质纯化的趣味之旅当蛋白质在细胞里被表达出来后，就像一堆宝贝混在沙子里一样，我们得把蛋白质这个宝贝给挑出来，这就是蛋白质纯化啦。
这可不容易呢，因为细胞里有各种各样的东西，有其他的蛋白质，有核酸，还有各种小分子。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
蛋白表达纯化步骤
一证明目的蛋白有表达1 挑取一单菌落接种于含（AMP，终浓度为100g/ml）的3ml液体LB培养基中37℃，250rpm 培养过夜。
2 将过夜培养菌液以1:100转接于含抗生素的100ml液体LB中，37℃，250rpm 3.5h（大量培养至OD600=0.6左右）3 取出1ml菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养物加入IPTG至终浓度为1mmol/L。
继续震荡培养4h。
4 以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液做对比，SDS-PAGE检测。
结果如图一1未诱导2未诱导3诱导后4诱导后二表达的情况，是可溶还是沉淀1 将上述的37℃诱导的菌液离心（4℃，12000,5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。
2 重悬于0.9% NaCl溶液的菌体离心，（4℃，12000,5min），弃上清（0.9% NaCl溶液），得菌体，称菌体重量，悬于8ml PBS（PH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/ml的菌液终浓度。
3 超声波破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声波设置如下：功率：400W 工作：15min 间隔：45s 全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加DNA酶会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没有加DNA酶），不然分不开）4 将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000,5min），分别收集上清和沉淀，各取1ml，加入1ml 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如图2三探索可溶表达条件有上述结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性表达，但是量很少，大部分以包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明蛋白的表达量很高，上清可溶性蛋白的可操作性等因素的干扰优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶性蛋白的表达条件，最终加大上清可溶性蛋白的含量，以便实现下一步实验的进行。
全式金蛋白表达与纯化的实验
C端融合：
构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译起始会干扰纯化
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用融合标签 • His·Tag • GST·Tag • MBP·Tag
pET系统 pGEX系统 pMal系统
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用表达载体系统
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体
表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
全式金蛋白表达与纯化的实验
• 启动子 • 融合标签 • 常用表达载体系统
表达载体
全式金蛋白表达与纯化的实验
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： • trc启动子： • tac启动子：
•T7/T7lac启动子：
热诱导启动子 化学诱导启动子 trp+lac杂交启动子 trp+lacUV5杂交启动子； pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB） pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）
全式金蛋白表达与纯化的实 验
全式金蛋白表达与纯化的实验
上篇 原核表达
• 原核表达概述 • 原核表达策略选择 • 表达结果验证 • 常见问题与实验例
全式金蛋白表达与纯化的实验
原核表达概述 ➢原核表达原理概述 ➢表达载体 ➢表达菌株 ➢表达条件
全式金蛋白表达与纯化的实验
目的基因
原核表达原理概述
构建
tac、trc…… (pGEX、pMal)
特性 适用于非T7启动子的表达系统
T7/T7lac (pET，pEASY)
T7/T7lac (pET，pEASY)
全式金蛋白表达与纯化的实验
strep标签纯化蛋白步骤
strep标签纯化蛋白步骤一、引言蛋白纯化是生物学研究中非常重要的一个步骤，通过对目标蛋白进行分离和纯化，可以获得高纯度的蛋白样品，为后续的结构和功能研究提供可靠的基础。
strep标签是一种常用的蛋白纯化标签，具有高亲和力和高特异性，被广泛应用于蛋白纯化领域。
本文将介绍strep标签纯化蛋白的步骤和技术。
二、strep标签纯化蛋白的步骤1. 基因工程构建含有strep标签的目标蛋白表达载体需要将目标蛋白的编码序列与strep标签的编码序列进行连接，构建含有strep标签的目标蛋白表达载体。
通常使用重组DNA技术，在目标蛋白的N端或C端引入strep标签的编码序列，使其与目标蛋白融合表达。
这样，在细胞内合成的目标蛋白就会带有strep标签。
2. 目标蛋白的表达与细胞培养将构建好的目标蛋白表达载体转化至适合的宿主细胞中，如大肠杆菌。
经过培养和诱导，目标蛋白将在细胞内得到高效表达。
细胞培养过程中，需要注意选择适当的培养条件，如温度、培养基组成等，以确保目标蛋白的表达量和质量。
3. 细胞破碎与裂解经过培养和诱导后，细菌细胞中含有大量的目标蛋白。
为了获得目标蛋白，需要对细胞进行破碎和裂解。
常用的方法有超声波破碎、高压融菌等。
破碎后，目标蛋白被释放到裂解液中。
4. 蛋白裂解液的预处理裂解液中通常含有大量的杂质蛋白、核酸、小分子化合物等。
为了提高后续纯化步骤的效果，需要对裂解液进行预处理。
可以通过离心、滤过等方法去除细胞碎片、沉淀杂质等。
5. strep标签亲和层析纯化将预处理后的裂解液加载到含有strep标签亲和树脂的层析柱中。
strep标签与亲和树脂之间形成特异性的结合，目标蛋白会与亲和树脂特异结合，而其他杂质蛋白则流经。
接着，通过洗脱缓冲液将目标蛋白从亲和树脂上洗脱下来。
6. 洗脱产物的后续处理洗脱得到的产物中仍可能含有一些杂质，需要进行进一步的处理。
可以通过柱洗脱、凝胶电泳等方法进行杂质去除。
最终得到的产物即为纯化后的目标蛋白。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白质的表达纯化及结晶
2.3.2.2 蛋白质表达、纯化（1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。
（2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。
（3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。
（4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。
（5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。
（6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。
流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。
使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。
由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。
为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。
（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。
然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。
表达纯化蛋白基本步骤
蛋白表达纯化的基本步骤包括：质粒转染、细胞培养、蛋白质收集、蛋白质纯化和蛋白质鉴定。
其中，质粒转染是表达蛋白的第一步，通过将质粒导入细胞中，使细胞表达出目标蛋白。
细胞培养是将转染后的细胞培养在合适的条件下，使其持续表达蛋白。
蛋白质收集是在细胞培养过程中收集蛋白质，通常采用离心、过滤或凝胶过滤等方法。
蛋白质纯化则是将收集到的蛋白进行分离和纯化，以去除杂蛋白和杂质，从而获得高纯度的蛋白质。
最后，通过蛋白质鉴定来确认所纯化的蛋白是否满足要求，通常使用SDS-PAGE、Western blotting和MALDI-TOF等分析方法。
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蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、取适当相应蛋白高表达得动物组织提total-RNA.2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽，要加上适当得酶切位点与保护碱基。
3、RT-PCR. KOD酶扩增获取目得基因c DNA、4、双酶切，将cDNA、克隆入PET28 / 3 2等表达载体.5、转化到DH5a感受态细菌中扩增，提质粒.6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。
表达菌株如BI2 1 （D E 3 ）, Rosett a garni （D E3）、BI2 1 Codon（DE3）^«7、蛋白得诱导表达.1 ）将表达菌株在3nilLB培养基中摇至O D=0 . 6左右，加入IPTG,浓度梯度从25 U M到Im M37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。
2）3 DS-PAGE电泳检测目得蛋白得表达.注：目得蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白得50%以上，在胶上可以瞧到明显得粗大得条带。
3）将有表达得菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录I PTG浓度范鬧。
甘油就是用0、22 P mil滤除菌得，储存浓度一般就是30^-60%.使用时自己计算用量。
4）用上述【PTG浓度范围得最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（14 0 - 1 8 0rpm）. 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：［、如果表达得蛋白对菌体有毒性，可以在加1 PTG送前得培养基中加入:L%得葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌得繁殖消耗殆尽，不会彫响后而得表达。
2、保种可以取一部分分成5om -管，每次用一管，避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达，则扩大摇菌。
1）取保种得表达菌株先摇1 0 ml 3 7度，SOOrpm摇至0D>=1. 5,约5 h左右，视菌种得活性而异，也可过夜摇菌。
2）将上一步中得8m I加入300 ml培养基中37度,2 50rpm摇至0 D=ls 0左右（约2、5h〜3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用得浓度.）注：菌液浓度要适当得浓一些，否则第二天收集不到足够得菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
拿起锥形瓶对光摇动，瞧到有大量云雾状菌体即可•另一方法就是，将手指放在瓶底晃动，瞧不淸手指为宜，不过此法宜受气泡影响。
3）过夜摇菌，使用包涵体检测得温度（1 8°左右），转速140 r pm左右。
4）将菌液eOOOrpm, 4m i n,4度离心收集菌体。
加入2 0mMPBS.洗一遍后用平衡缓冲液重悬。
每2 50ml菌液用3 0 ml到5 0ml平衡缓冲液，视菌液得浓度而楚。
可用4支50m I得离心管同时离心，但就是,离心管要重复使用，用完后洗净保存。
10、超声波裂解。
1）用6mm变幅杆，35%功率，3、5s工作，7$休息，5 0 mi n即可。
注意:1、要冰浴.2、要随时观察裂解情况以防意外。
3、要将探头探入到溶液中下部，尽虽不要打出大量气泡。
一般溶液量比较大得时候不会出现大量气泡。
4、正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳得声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整。
溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后而3 0 00转离心时，如果沉淀少说明裂解得好）。
5、超声波破碎仪工作30分min要休息5min （即关闭总电源开关）。
注意：1、如果纯化得蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）, PMSF工作浓度为:L%。
2、如不能判断就是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟,6 0分钟足够裂解.11、取得上清1）将破碎好得溶液收集到50m I离心管中.1000 0 rpm,15min,4°离心。
沉淀为包涵体、细胞碎片与未破碎得细胞.轻轻得将上淸倒出，尽S不要倒出沉淀。
（此时可以测量一下P H值,P H值最好在7、5左右.平衡buffer得pH就是7、8左右,裂解后上淸就会在7、5左右。
）12、纯化上淸一摸洗脱条件。
1）钦柱处理。
将:Lml蝶柱吸入空层析管中，待其中得液体流完后加入平衡缓冲液3rnl。
2）将1 Oml上淸加到已经平衡过得NI柱上，并将过柱得样品重复上样3次。
（若就是流速慢可以在柱子下而加一个针头,或者用IE得枪将胶体吹散。
）取2 0 U 1过柱后得样品，以备跑胶。
3）分别加20mM、40mM、6 0mM. 80 mM得咪呼梯度来洗脱杂蛋白。
每个梯度分別得上样量为4rnl、2m 1 . 2 ml、2rn 1。
每个次上样得液体分前面Im 1与后而1ml分别收集入EP管中，以备跑胶.注意：理论上就是要将收集得溶液测量280nm处得吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度得洗脱.实际上测不到零，怎么都会有一点得，上面说得量已经做够洗脫了.4）加Eluti 0 n Bu f fe r将目得蛋白洗脫。
上样量为4、5ml （将前而得0、5口1单独接入EP管，再将后面得4 ml接入另外两个EP管）,留跑胶样品。
5）加MES将NI柱重生。
MES加1 Oml,流完后再加10ml M i I i qH20.流完后保存于2倍体积得20%乙醇中，镰柱至少能重复利用6次。
（尿素可能对NI柱有损伤。
）注意:所有溶液使用前都要确定其P H就是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。
银柱所用溶液MES得P h =5、0,其余 E q U ili b r a t ion Bu f f e r pH=7、8 ,上淸pH= 7、5 ,Wa s h Buf f er p H=7^ 0» Elution Buffer pH=7 2。
13、跑胶验证.1）跑2块0、75mm得PAGE胶，把所有得样品都加上去,注意两块胶得浓分离比要相同两块胶才会比较一致。
2）跑胶顺序：负对照、正对照、上淸、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E 2、MES3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品5 0 min左右。
（也可以300V, 30min.只就是图没有160V好瞧4）考马斯亮蓝染色。
一般染色2h即可。
5 ）脱色。
先用脱色剂1脱15m i n,再用脱色剂2脱过夜。
14、纯化上清----- 收集目得蛋白1）将重生得钦柱再次平衡（即加Equilibration Buffe r 3ml）.2）重复步骤1 2中得操作,只就是wash时只用步骤12中摸好得咪呼浓度洗。
15、跑胶验证。
同步骤13这次胶图要跑得漂亮一点（用160 V）.保存好.16、透析.1）配制2 L透析液（配方见附件1 ），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。
2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸1 0 min,用MIL 1 Q 1120充分洗净.3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹得更牢），将洗脱得蛋白样品加入其中，置入提前预冷得500ml透析液（20mM P BS+50mM Na Cl）中。
冰浴下轻微碱力搅拌2 0mi n 后置入4°冰箱1、5h后换液.透析3次即可.注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰得2L大烧杯中。
冰浴以防活性降低。
1 7、浓缩。
1） 将透析好得样品连同透析袋一超放在白色盒子中，用预冷得聚乙二醇2 0 0 0固体包埋.2） 30min 后将吸水后呈浆糊状得聚乙二醇去除，加入新得固体聚乙二醇。
3） 每隔lOmin 观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。
4） 透析袋用完后，洗净，保存于2 0 %乙醇中4°存放。
注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高， 不易发现小颗粒或絮状沉淀，要瞧仔细。
如果瞧不到,可根据自己估计得蛋白量留1-2川体 积.用透析液将透析袋表面得聚乙二醇洗掉，吸取其中得溶液分装后一20度保存。
18、 超滤法浓缩、透析蛋白。
使用超滤法就可省去16、17两步。
1 ）将4ml Elu t ion 得到得蛋白溶液加入超滤管中.2） 配平.3） 7 400g,30min, 4°离心，结束时4m 1变为1 ml 左右•浓缩4倍。
叮根据需要选择 不同得离心时间，以达到不同得浓缩倍数。
可以几次得E 山t i on 液一起浓缩。
4） 加入需要得蛋白储存液至4ml,离心■重复操作可以使Elution 液逐渐换为所需得蛋 白储存液。
蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM N a Cl 或适当浓度与p H 得tris-HC I 溶液。
如果蛋白有沉淀达不到预立浓度可以添加适当得甘油（1%-5%即可）助溶.5） 收集。
将溶液从超滤管中收集到EP 管中，标记好储存液得成分，蛋白需称，蛋白 浓度（测量后），制备日期。
注：超滤管得便用方法见附件419、 蛋白浓度测迫.见附件32 0、蛋白活性测试。
转染细胞测量荧光.21、 抗原处理。
蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。
22、 注射兔子。
选择合适得注射方式与合适得免疫程序。
2 3、收集免疫血淸。
提取抗体。
2 4、抗体效价评泄。
附件1所需溶液配方：1） 2 0 mM P B S ： 20 mM $ od i um pho s p hat e, 300 mM NaC I pH 7、4试剂名称 NaH2PO4— 2 H20 N a 2HPO4-12II2O NaCi用量（g ） IL 0、5928 5、8 0 2192 1 7、5322） Equ i libration B u f f er （平衡缓冲液）：3） Wash Buffer （淸洗缓冲液）：PBSH 7、44） Elution Buff e r{洗脱缓冲液）：PBS5） MES ＜再生缓冲液）： 1M sodium chloride; pH 5、0 •即 0、3904g MES+0、58 4 4 g NaC 1、6） 透析袋处理液：2%{w/v ）碳酸氢钠与1 mm 0 1 /L （p H8、0） EDTA7） 透析液:20mM PBS+50mM NaCI （2、92g ）试剂名称 N aH2PO4-2H 2 0 Na2ll P04-12H2O NaCI用量（g ）lL 0、5928 5、8 02192 2、92gT I PS ： 1 一4得溶液可以一起配制Q 先配1 Om 1 8M 得咪哇。
再配1L 得PBS,用500ml 水 将PBS wit h 1 0 mM 咪哇 pH 7、4with 2 5 mM/5 0 mM/7 5 mM 咪 p with 25 0 mM 味醴 pH 7、4 20 mM 2— (N —m o rp h oli n e )—ethanesu 1 fonicacid. 0、试剂溶解,取两个50ml与一个150m 1分别加到两个1 0 0ml瓶子与一个500ml瓶子中，作为W a sh B uffe r、EI u t i on Buf f e r * j E q u i 1 ibra t i on Buff e r,再向其分别加入适当体积得8M咪哇。