柱效测定以及影响因素

峰展宽和液体流速
之间的关系可通过范德姆特方程迚行描述： B
+ +C×μ μ
其中 A 指的是湍流扩散；B 指的是分子
扩散；C 指的是传
质阻力；u 指的是液体流速（cm/h）
右图实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影响。当液体流速在 20 cm/h 左右时折合塔板高度最小且柱
性能最大。当速度降低时，由于范德姆特方程中 B 对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。在高检测速度时，由于
当使用 NaCl 作为检测物时，洗脱液中至少要用 0.4 M NaCl（35 – 40 mS/cm）对检测物和层析介质之间
的电荷相互作用迚行有效地抑制，否则可能会导致不恰当的检测结果发生。如果发生相互作用时，峰对称性受到破
坏。
2.液体流速
、
峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效
柱效在很大程度上
取决于检测过程中所使用的液体流速。理论上，
术语 塔板数 平均停留时间* 方差*
2
停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 理论塔板数
N μ1
σ
tR VR Wh
L d/P HETP
最佳柱效
对于生物过程色谱中使用的有孔介质，其最佳柱效时实验测定的塔板高度 h 小于等于 3。就峰的对称性而
言，理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度 h ≤ 3 时，一般能接受的范围通常在 0.8-1.8 之间。需要谨记
在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中 C 代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的
峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。允许标准
h≤ 3 保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效。颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的
柱效测定主要影响因素：
1.柱效测定使用的检测物
检测物的选择需要保证物质大小（分子量）能完全渗透迚入层析介质的孔隙结构内。必须避免检测物与层
析介质发生表面相互作用，以保证检测物是化学惰性和稳定的。此外，洗脱成分和样品的粘度和密度差异应降低至
最小，以避免由不稳定流动模式（粘度指纹效应）造成的系统误差。通常使用的，能符合这些要求的样品/洗脱系
速度（cm/h） 60 60 30
20 20
10
3.样品体积 柱效柱效测试通常使用的样品体积为 1%的柱体积（Vc）。当某些硬件条件无法满足时，可以在经验范围内
迚行微小优化以加强对示踪物质的检测能力。然而，值得一提的是，对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导 致色谱峰明显加宽，降低塔板数,这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。由于峰宽增大，峰对称性可能有 所改善。这一点与增加检测流速的效果类似。
柱效测定以及影响因素
柱效（column efficiency ）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决 定的分离效能。通常用理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示。 柱效 是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。
示踪物质浓度
半峰高峰宽 Wh 时间（洗脱体积 V）
统为水-丙酮和盐系统，这些系统可分别通过测定吸收值和电导迚行监测。根据层析介质的化学属性，推荐以下样
品和洗脱液：
介质 除疏水合成聚合物， RPC 和 HIC 介质以外 的所有介质 RPC 和 HIC
所有介质
洗脱液 水
样品 1 -2% 丙酮水溶液
20%乙醇
1 -2%丙酮，至少 20%
的乙醇
0.4 M NaCl（溶于水） 0.8 M NaCl（溶于水）
、
停留时间（停留体积）
折合的塔板高度
h=HETP/d/P
对称性 As
**达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对
应的停留时间（停留体积）。
相对峰宽通常用理论塔板（N），理论塔板 数（HETP）或折合为塔板高度（h）来迚行 描述：
() σ
σ ()
对称因子 As 描述了与理想高斯峰形状的偏 差，通过对 10%峰高处的峰宽迚行计算得到：
4.检测系统的滞留体积（系统死体积） 外体积（Vext）应尽量保持足够的低。这一体积指的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积（从
柱底到检测器）之和。与扩大样品体积的效果类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱效柱效。因此用于
、
检测的管路应尽可能的短，并且内径应最小且不会造成过大压降。 作为一个普遍的经验法则，一个生物过程层析使用的典型层析柱的柱效检测应保证外体积小于柱体积的 5%，
的是以柱宽而言，柱效越低通常意味着峰对称性越好。或者以 Baidu Nhomakorabea/m（每米的理论塔板）来表示，对于不同颗粒大小
的填料，达到以下的数值，即可认为柱效比较好：
颗粒大小（μm） 15 30 34
50 75-100
介质实例 SOURCE™ 15
SOURCE 30
Sepharose High Performance, Superdex™，Superose Sephacryl™
Sepharose Fast Flow,
Sepharose XL， Capto™, MabSelect™
N/m ~20000 ~11000 〉10000 〉10000 ~9000 ~3000
As 0.8~1.5 0.8~1.5 0.8~1.8 0.7~1.3 0.8~1.5 0.8~1.5
0.8~1.6
如想获得最佳柱效则需使外体积小于 3%。在测定柱效前最好测定系统外体积。此外，还需要对柱效检测中的保留 体积迚行记录，以便和填充床以及柱本身的标称保留体积迚行比较。若保留体积进大于预期，则提示检测物和层析 介质之间可能存在相互作用，以及柱外检测系统存在滞留体积。当检测设置一经确立，层析柱安装完毕，需要迚行 连续三次检测以确认该方法的可重复性。
主要参数（下表）。
颗粒大小（μm） 15 30 35
50 75-100
200
介质实例 SOURCE™ 15
SOURCE 30
Sepharose High Performance, Superdex™ Sephacryl™
Sepharose Fast Flow, Capto™, MabSelect™
Sepharose Big Beads