区带毛细管电泳法

实验三区带毛细管电泳法(CZE)测定中药槐米中芦丁的含量

一、实验目的

1、初步掌握毛细管电泳法的原理

2、掌握毛细管电泳仪的使用方法

3、掌握中草药定量分析的基本过程及方法

二、实验原理

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)，又叫高效毛细管电泳(HPCE)。CE统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。

图1、高效毛细管电泳仪示意图

1－高压电源；2－毛细管；3、4－缓冲溶液瓶；5、6－铂电极；7－检测器毛细管电泳的突出特点是：

a、毛细管电泳的仪器简单、操作简便，容易实现自动化

b、分析速度快，分离效率很高

c、操作模式多，分析方法开发容易

d、实验成本低、消耗少

e、应用范围极广

三、仪器及试剂

1、仪器

Lumex 105 高效毛细管电泳仪

JS-3050色谱工作站

TGL-16C台式离心机

WR-E型微波样品制备系统（北京美诚公司）

2、试剂

槐米，芦丁标准品，无水乙醇(AR)，硼砂(AR)，NaOH(AR)，二次蒸馏水。

四、实验步骤

1、样品溶液制备

(1)草药槐米经烘干、粉碎，过40目标准筛。准确称取0.10g粉末于于50mL

锥形瓶中，加入10ml乙醇，微波萃取10min。萃取结束后，萃取液经过抽滤除去固体后，蒸干，用无水乙醇定容至25ml。

(2)将定容后的槐米提取液分装至2个5ml的离心管中，在6000rpm的转速

下离心10min，取离心后的上层清液，将滤液收集合并，保留大约4ml溶液，冷冻保存，即为待测液。

2、缓冲溶液配制

(1)准确称取Na2B4O7.10H2O固体9.5343g，在100ml的烧杯中用二次水溶解

(需水浴加热)，待固体全部溶解并冷却至室温后，定容至250ml，即得到0.1mol/L 的Na2B4O7溶液。

(2)用移液器取0.1mol/L的Na2B4O7溶液100μl用二次水稀释配制成

10mmol/L的溶液1ml，稀释两份，置于1ml离心管中，用作电泳缓冲液。

3、毛细管电泳仪的操作要领

(1)开机预热20min。

(2)设定工作温度为25o C。

(3)每天毛细管使用前须依次用0.5mol/LNaOH溶液冲洗5min，二次水冲洗

5min，冲洗之后两端用二次水液封。

(4)每次电泳前，须用二次水冲洗2min，再用缓冲液冲洗2min。

(5)本实验的进样条件为30mPa压力，10s时间。

(6)电泳运行条件为15KV，20min，在启动高压的同时，色谱工作站的记录

系统也触发开始。

(7)电泳结束后，在计算机的色谱工作站软件内保存好色谱图，并打印输出。

4、槐米中芦丁含量测定

(1)取槐米样品溶液100μl，置于1ml离心管中，加入20μl 的0.1mol/l

Na2B4O7溶液和880μl二次水，扣紧离心管盖子，摇匀并在离心管上做标记。

(2)将装有配制好的样品溶液和缓冲溶液的1ml离心管放入离心机中，在

6000rpm的转速下离心脱气10min。

(3)离心后得到的10mmol/L的Na2B4O7溶液即为本实验的运行缓冲溶液，做

标记的样品溶液即为电泳仪可检测的样品溶液。

(4)照前述电泳条件测定该样品溶液，得到谱图保存并打印。

5、芦丁标准曲线

准确配制0.005mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml 的芦丁标准品溶液，分别在前述电泳条件下做检测，得到一系列谱图，保存。

五、数据处理

1、绘制标准曲线。根据芦丁标准品的电泳谱图，得到在此电泳条件下，芦丁的保留时间，同时从谱图上可计算出芦丁的峰面积。由芦丁峰面积与芦丁浓度的对应关系，绘制“峰面积——浓度标准曲线”。

2、从待测样品谱图中，根据峰保留时间确定芦丁峰，记录该峰的峰面积，从标准曲线上查得对应的浓度值。经过计算得出槐米生药中的芦丁质量百分含量。

标准曲线方程：Y=12.325+1652.875X

六、思考题

1、简要说明毛细管电泳法(CE)同液相色谱法(LC)的区别与联系。

2、进入毛细管电泳仪的溶液，为什么必须经过离心脱气这一步骤？如果没有脱气，将会对实验结果产生什么样的影响？

3、微波萃取结束后，为什么要等到冷却之后才能开罐？

七、参考文献

1、付若农等编著，近代色谱分析，国防工业出版社，1998年

2、邹汉法等编著，毛细管电色谱及其应用，科学出版社，2001年

3、国家药典委员会编，中华人民共和国药典（一部），化学工业出版社，2000年版

附录：Lumex Capel 103R 毛细管电泳仪简介

图2、Lumex Capel 103R 毛细管电泳仪1—高压块挡板

2—指示面板

3—分离盒盖板

4—装有毛细管的分离盒

5—显示器

6—控制面板

7—电源开关

8—可动支持套拉杆

9—支持套提升杆

10—可拆卸高压块

11—隔离高压挡板