浙江大学生物化学丙实验报告6

课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：方祥年成绩：__________________ 实验名称：质粒DNA的微量制备及电泳检测同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛

一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法；

2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；

3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。

二、实验内容和原理

1、实验内容

①质粒DNA的提取

②DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定

2、实验原理

①质粒：

质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载

体。

②从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤：

a细菌培养使质粒大量扩增；

b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；

c进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。

③碱裂解法来分离纯化质粒DNA：

在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。

④DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:

DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。

⑤影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：

DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移

率越小。

DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA。

胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；

电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度）。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。

电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。

碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大。

⑥质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度：

环形双链DNA分子有三种构型。

第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快；

第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢；

第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。

这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。

⑦实验有关试剂的作用：

溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。

溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。

溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/L NaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。

酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。

氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于