葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
实验步骤
1．凝胶的处理：取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液 （本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充 分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破 碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加 热至将近1OO℃，还可以排除凝胶内部的 汽泡。
2．装柱：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓 冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左 右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上 清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次 性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶 后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加 盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实 验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱 床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是 否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
3.
上样： ①用蒸馏水溶解胰蛋白酶含量为l5mg/ml，加样 体积为0.4cm高。 ②吸去柱床上的溶液，直至胶面刚露出为止。 ③将样品沿柱壁四周缓慢加入(别搅动胶面) ④打开下流出口，使样品进入胶床。 ⑤再如上法，加１－2次小体积的洗脱液冲洗内 壁，完成后，将洗脱剂与流入口相接进行洗脱。
4．洗脱：借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为 4m1/3Omin。收集时用自动部分收集器收集，每 管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱 仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时， 还需要在分光光度计上测定OD28Onm来定）。 5．保存：样品洗脱完毕，根据层析图谱和自动部分收集器 的数据将各组分合并，保存可以冷冻，也可浓 缩。 6. 凝胶的回收：取下层析柱，将上下口打开，从上口处用 吸耳球一吹胶即可从下口流出， 凝胶可以 灭菌保存，干燥保存（乙醇乙醚脱水干 燥），和防腐剂保存。
ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２） （≥１）
凝胶层析法分离纯化蛋白质
了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
8
实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
7
实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性 质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲 和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为 流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质 溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化 层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理
交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理在生物化学和分子生物学中，交联葡聚糖凝胶层析是一种常用的蛋白质分离和纯化技术。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
葡聚糖凝胶操作方法
【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。
若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。
蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。
葡聚糖凝胶测蛋白质分子量
不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的 10倍。 例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。因此，“G” 反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而 小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不 同的物质得到分离。
试剂和材料
洗脱液：0.05M Tris-HCl缓冲液（pH7.5），0.1M KCl溶液：称取12.12g Tris，15g KCl，先 用少量去离子水溶解，再加入6.67mL浓HCl，用去离子水定容至2L。 蓝色葡聚糖2000(10mg/ml)；Sephsdex G-100；牛血清白蛋白（2mg/ml)（Mr 67 000); 细胞色素c（Mr 12 800） 器材 层析柱 蠕动泵 核酸蛋白检测仪 自动部分收集器 记录仪
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。Vt是由三 部分组成，包括内水容积Vi、外水体积V0 和凝胶本身的体积Vg 。内水容积Vi是凝胶 孔隙所占的体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后 的重量求得。外水体积V0指凝胶颗粒间的自由空间所占的体积，即存在于柱床内凝胶 颗粒外面空隙之间的水相体积。利用有颜色以便于观察的蛋白质，分子量约200万的蓝 色葡聚糖-2000通过实际测量求出 。
当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不渗入到凝胶内部，只需V0体积的 洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端；相反，如果样品体积小于孔隙，则需要V0＋Vi 体积的洗脱液，才能将它们由一端洗脱到另一端。中等分子（分子大小在上述两种极 限之间）所需洗脱液体积介于两者之间，Ve＝V0＋KdVi（0<Kd<1）， Kd为分配系数， 它表示一种物质在孔隙内的渗透程度，相当于这种物质在孔隙内所占体积和孔隙总体 积的比值。
凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤法分离蛋白质实验原理ONE:分子筛层析molecular-sieve chromatography凝胶过滤层析gel-filtration chromatography分子排阻层析molecular exclusion chromatography凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开。
TWO:凝胶过滤介质不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。
常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）。
凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。
蛋白质分子直径>凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。
THREE:交联葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。
Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离范围Mr（肽和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000Sephadex G–50 1500-30000Sephadex G–75 3000-70000补充说明：凝胶过滤层析特点❃设备简单，操作方便❃分离条件温和，样品回收率高（100%）❃实验重复性好除盐：☊选择孔径小，交联度大的凝胶。
☊Sephadex G-25全排出的最小分子量为5000☊Sephadex G–50全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
实验四 凝胶过滤法测定蛋白
验
四
凝胶过滤法测定 蛋白质分子量
一、 实验目的与要求
掌握凝胶过滤法分离蛋白质的原理 掌握凝胶过滤法测量蛋白质分子量的原 理 掌握凝胶过滤法分离蛋白质的基本操作 技术
二、实验原理
用于凝胶过滤的凝胶主要有： 葡聚糖凝胶—sephadex 琼脂糖凝胶—sepharose 聚丙烯酰胺凝胶—biogel 凝胶为不溶于水的颗粒状高聚物。颗粒 为三维网状结构。
Ve/V0
三、实验操作方法
凝胶溶胀 装柱 静置 平衡
测定外水体积（V0）
（蓝葡聚糖的洗脱体积）
标准曲线制作
（ cytc、牛血清蛋白） (一次上样洗脱测定其各蛋白质的Ve)
未知样品测定
（上样洗脱测定其Ve）
四．实验结果与分析
求出V0 求出各标准蛋白质的Ve 计算出各标准蛋白质的Ve/V0 以各Ve/V0为横坐标，标准蛋白lgM 为纵 坐标作曲线 求出为知样品的Ve/V0， 在标准曲线上查 出相应的lgM 而求出其分子量大小
五．实验注意事项
凝胶要充分溶胀 上柱时凝胶不能有气泡和断层现象 上样时防止凝胶表面被破坏 ，不要滴加 洗脱时速度不能过快，同时防止冲动凝 胶表面（ml/2-3min） 在上不同样品时，凝胶柱床要冲洗干净。
ห้องสมุดไป่ตู้
当被分离的物质其分子小于网状凝胶的网 孔时，则分子就进入凝胶内部。洗脱时就 会从一个凝胶颗粒出来而进入另一凝胶颗 粒。则分子所经过的流程较长，如果分子 大于凝胶网孔时，则分之不能进入凝胶网 孔而从凝胶颗粒之间的空隙流出，流程较 短。 分子越大 流程越短 最先出来 分子越小 流程越长 最后出来
被分离的物质的分子量的对数（lg）于其 洗脱体积成反比 lgM
凝胶层析技术——葡萄糖凝胶的使用
凝胶层析技术——葡聚糖凝胶的使用摘要：本文综述了凝胶层析技术中所使用的葡聚糖凝胶的使用方法，及注意事项。
关键词：凝胶层析，葡聚糖凝胶，使用，注意事项引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。
1959年，Porath和Flodin 首次用一种多孔聚合物——交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
此项技术中，凝胶的选择尤为重要，因此凝胶的使用及使用时的注意事项尤为重要。
1、凝胶层析原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
2、葡聚糖凝胶的化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。
G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。
葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、
1
有效分配系数Kav
已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，将Vt-Vo代替Vi， 则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo）
Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联 度大的凝胶差别大。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当 流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出 来，这一点为凝胶层析法的特点
层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。
柱形必须根据层析介质和
分离目的而定。待分离物
质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖柱”. 要求:垂直 柱面平 无气泡 无节痕 松散 均匀
灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱 床高度，不能时断时续，否则将出现分层或 “纹路”等毛病。若在灌好胶后才发现“纹 路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响 层析效果。
（8）实验纪律：不迟到和缺席。实验室的卫生要轮流值日。
成绩评定
平时成绩：考勤 实验技能测试和实验报 告等 50～ 60%
期末理论考试： 50 ～ 40%
实验 葡聚糖凝胶层析法 分离蛋白质
张萍萍
一. 目的和要求
1. 掌握葡聚糖凝胶柱层析法的分离原 理及基本操作技术: 装柱 平衡 加样 洗脱收集等步骤.
分配系数 Kd =（Ve － Vo）/ Vi
Kd 可以有下列几种情况： (1)当Kd=O时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子
物质(全排阻)，洗脱容积等于空隙容积(组分I)。 (2)当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗
脱容积应为空隙容积与内容积之和(组分Ⅲ)。 (3)当0<Kd>1时,Ve=Vo+KdVi,即表示组分不同大小可部分进入凝
葡聚糖凝胶分离原理
葡聚糖凝胶分离原理
葡聚糖凝胶是一种多孔的凝胶材料，与其他化学性质不同的化学物质可以通过不同的孔径大小和形状逐层渗透和分离。
这种凝胶的孔径大小可以通过改变它的交联度和使用不同的凝胶剂来调节。
葡聚糖凝胶常用于生物化学和分子生物学领域，用于分离和纯化不同大小和类型的生物大分子，如蛋白质和核酸。
由于葡聚糖凝胶的分离能力和选择性，它已成为一种重要的实验室工具，被广泛应用于分子生物学、生物化学、生物医学等领域。
- 1 -。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
混合物中某一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱，通常用 分配系数(Kd)来表示。其定义为： Kd=（Ve一V0）/ Vi
Ve，某一被分离物成分被洗脱时所用洗脱液的体积
Vo，凝胶颗粒间自由空间的总体积 Vi，胶颗粒内部孔穴的总容积 大分子物质，其Kd=0，小分子能全部进人胶粒内的Kd=1，中等 大小分子，Kd在O～1之间。 凝胶过滤法的分辨率（ρ）是凝胶层析中的另一个主要特征常数。 从数学角度上可以表示为：
Байду номын сангаас
葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理 实验材料与器材 实验步骤
实验原理
凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为 载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，各物质 在柱中存在两种运动，一是随洗脱液垂直向下移动，二是无 定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子，不能进人胶 粒内部，便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出，称为全排出)；小 分子物质，直径小于凝胶孔径，能自由进出能容纳下它们的 孔穴，绕道而行，结果在柱中的保留时间增长而最后流出;中 等大小的分子，能进人部分胶粒内部，从而在柱中的保留时 间较大分子长，但较小分子短，中间流出。于是，流过凝胶 柱的混合物按其分子大小W被分离。
3.
上样： ①用蒸馏水溶解胰蛋白酶含量为l5mg/ml，加样 体积为0.4cm高。 ②吸去柱床上的溶液，直至胶面刚露出为止。 ③将样品沿柱壁四周缓慢加入(别搅动胶面) ④打开下流出口，使样品进入胶床。 ⑤再如上法，加１－2次小体积的洗脱液冲洗内 壁，完成后，将洗脱剂与流入口相接进行洗脱。
4．洗脱：借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为 4m1/3Omin。收集时用自动部分收集器收集，每 管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱 仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时， 还需要在分光光度计上测定OD28Onm来定）。 5．保存：样品洗脱完毕，根据层析图谱和自动部分收集器 的数据将各组分合并，保存可以冷冻，也可浓 缩。 6. 凝胶的回收：取下层析柱，将上下口打开，从上口处用 吸耳球一吹胶即可从下口流出， 凝胶可以 灭菌保存，干燥保存（乙醇乙醚脱水干 燥），和防腐剂保存。
实验步骤
1．凝胶的处理：取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液 （本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充 分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破 碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加 热至将近1OO℃，还可以排除凝胶内部的 汽泡。
2．装柱：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓 冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左 右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上 清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次 性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶 后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加 盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实 验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱 床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是 否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。
ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２） （≥１）
Ｖ２、Ｖ１，是两种被分离物的洗脱体积 W１、W２，是两个物质的洗脱峰的宽度。两个相的物质要想完 全分离，ρ≥１。
实验材料与器材
胰蛋白酶（分子量为23KD）和牛血 清白蛋白（分子量68KD）混合物、层析 柱50cm×l.lcm、核蛋检测仪、部分收集 器、sephadex G一l50