酶联免疫吸附测定法开发及应用
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
鉴定半抗原与载体是够成功偶联的方法有多种如 紫外分光光度法、红外 波谱法、核磁共振谱法、电泳法、飞行质谱法等。其中以紫外分光度发应用 最为广泛。紫外分光光度法根据半抗原、载体蛋白及偶联产物间特征吸收峰 的差异鉴别偶联是否成功。
如下图所示：半抗原（二率甲喹啉酸，Q)的最大特征吸收峰在210nm左右， 载体蛋白（BSA）在235nm和280nm各有一个特征吸收峰，偶联产物(Q-BSA） 特征吸收峰出现在245nm左右（ Q 与BSA特征吸收峰之间）且在280nm附近出 现了蛋白质的特征吸收峰，故而可初步判定偶联成功。
单克隆抗体（Monoclonal antibody）：抗原通常是由多个抗原决定簇组成的， 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体.
杂交瘤细胞（Hybridoma）：是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B 细胞融合而成的细胞，同时保持B细胞抗体分泌功能和骨髓瘤细胞可在体外无 限增殖两种特征。
Bt抗原免疫小鼠
取出小鼠脾细胞
二氧化硅吸附
纯化的抗体
辛酸－硫 酸胺沉淀
杂交瘤细胞注入小鼠腹腔生长，
腹水含有大量单抗
测定阳性孔、分离 产生Bt抗体的细胞
在培养瓶中 培养杂交瘤细胞
融合
骨髓瘤细胞
HAT培养基中选择培养 只有杂交瘤细胞能生长
第四节 ELISA方法的建立
4.1 ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标 记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测 定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的 抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗 体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标 本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物 被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接 相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催 化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到 很高的敏感度。
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
碳化二亚胺法： 利用半抗原的氨基(或羧基)与载体的羧基（或氨基）联接
蛋白－COO－＋R－NH－CN－R’
+ HNR
蛋白－COO－C－NH－R’
蛋白－CO－NH－ Hapten ＋
R－NH－CO－NH－R’
＋ Hapten －NH2
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
测抗体时：标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标 本中抗体含量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。测 抗原与测抗体模式类似，小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
化学法偶联：一般选取蛋白质（载体蛋白）、多肽聚合等载体。半抗原 结构中含有羧基或者氨基的可直接与载体蛋白偶联，若不含有，则需要对 半抗原进行结构改造，引入羧基或氨基后，再与载体蛋白等偶联。此法应 用最为广泛。
2.6 半抗原修饰---活性基团引入
① 含有羟基：琥珀酸酐法
CH2
Hapten CH2OH ＋
4.2 ELISA的种类及其操作方法
A: 双抗体夹心法 B: 间接法 C: 直接法 D:捕获法测抗体 E:亲和素-生物素法
A: 双抗体夹心法
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原（如蛋白质 等），但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点 夹心。即可测抗原，亦可测抗体。
双抗体夹心法侧抗原---反应示意图
OH
+HOOC-C6H10-N=N+
HAPTEN
④ 含有酚基：氯乙酸钠法
HOOC-C6H10-NH2+NaNO2
OH
+ Cl-CH2COONa
HOOC-C6H10-N=N+
HAPTEN
2.6 半抗原修饰－载体种类与性质
蛋白质载体：免疫性强，易联接
常用载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白 (KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质 分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基 （等电点为7）、羧基（等电点2～4，大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ羧基）等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基 团则具有反应活性，可与半抗原中的对应基团结合。
1
概述
2
抗原合成
3
抗体制备
4
ELISA检测方法建立
第一节 概 述
1.1 .简介
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报 道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫 吸附测定法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 。它是继免疫荧光 和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世 以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
颗粒载体，如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、活性炭等；
其它大分子载体：淀粉核/、硫酸葡聚糖
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
戊二醛法： 利用半抗原的氨基与载体的氨基联接。
Hapten－NH3 ＋H3N-蛋白＋OHC－CH2－CH2－CH2－CHO
Hapten－N＝C－CH2－CH2－CH2－C＝N-蛋白
灵敏度高： 通常生化分析的最小检出值可达到10－3－10－6g水平，而免疫分析最小检
出值可达到10－9－10－12g水平， 近年来检测方法的灵敏度向着10－15g发展， 比一般生化分析提高1000－1000,000倍。 特异性：
由于抗原抗体反应的高度特异性，免疫分析具有很强的特异性。一种物 质(如激素)的免疫分析能辨别区分结构非常相似的物质。 操作简便：
（二氯甲喹啉酸）
第三节 抗体的制备
3.1 基本概念
抗体:由抗原刺激机体而产生的特异性球蛋白，如免疫球蛋白或抗血清等。
抗体效价（Titer）：又称抗体滴度，是在一定条件下，抗体经系列稀释后与 定量的抗原反应，以能检测出抗体存在的最大稀释倍数。
多克隆抗体（ Polyclonal antibody ）：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。
2.2. 抗原特性：
(1) 免疫原性：能够诱导机体产生抗体或形成免疫回答反应的特性。
(2) 反应原性：能够与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性。
(3) 特 异 性：由特异的抗原决定族决定，一种抗原只能诱发一种特异的免疫 应答，产生特异的抗体或致敏淋巴细胞，且只能与与其诱导产生的 抗体或致敏淋巴细胞发生反应。
抗体滴度曲线：选定一定量的标记抗原于不同稀释度的抗体，在4℃下作用一 定时间后，用分离剂分离抗原抗体复合物，并计算结合的百分率，以其为纵坐 标，以相应的抗体稀释度作横坐标，所得曲线为抗体滴度曲线，选取50％ 结合 率时抗体稀释倍数作为工作液。
3.2抗体种类与结构
抗体分为5大类：IgA、IgG、IgM、IgE、IgD 抗体结构：
牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清清白蛋白（OVA）分子中含有大量的赖 氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解 度。此外，这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时，其 活性基团仍呈可溶状态，因此，这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质。
近年来，有研究报道用人工合成的多聚肽(如PLL)作载体，能增加半抗原 的免疫原性，从而使产生特异性抗体的可能性增加，被广泛应用。
CH2
CO O
CO
Hapten CH2 OOC CH2 CH2 COOH
② 含有酮基：O－（羧甲基）羟胺法
Hapten－C=O +H2N-O-CH2-COOH Hapten －C=N-O-CH2-COOH
2.6 半抗原修饰---活性基团引入
③ 含有酚基：重氮化的对氨基苯甲酸法
HOOC-C6H10-NH2+NaNO2HOOC-C6H10-N=N+
间接法测抗原---反应示意图
C: 竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与 固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳 性反应呈色浅于阴性反应。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于 测定抗体 。
2.3. 构成抗原的基本条件
1) 异物性：即不是机体正常组织成分。 2) 化学性：分子量大，分子有一定的特殊化学结构。 3) 完整性：完整地进入免疫活性细胞所在的场所。
2.4 抗原的基本类型
1）天然（半）抗原：天然的生物、细胞及天然产物-颗粒抗原和可溶性抗原 2）人工抗原：人工化学改造后的抗原 3）合成抗原：经过化学合成的具有抗原性质的分子，主要是氨基酸的聚合
胞内：细胞破碎、释放抗原，然后进行分离、提取和纯化。
2.5 蛋白质抗原分离与纯化－细胞的破碎
SDS-PAGE
机械破碎
鉴定
细胞破碎
研磨 超声
干燥
非机械破碎
硫酸铵盐析法
纯化与浓缩
胞溶作用
聚乙二醇沉淀法
粗纯
冷冻干燥 真空干燥 酶溶法 化学渗透
有机溶剂沉淀法
精制
离子交换色谱
凝胶色谱
亲和色谱
吸附色谱
2.6 半抗原修饰
B: 间接法
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检 测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法的优点是只要变换包 被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的 关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果， 但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
第一节 概 述
1.2.基本原理
免疫分析是建立在标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)与限量的特异抗体(Ab) 的竞争结合反应，这种竞争作用构成了免疫分析的理论基础 。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
1.3. 免疫分析特点：
半抗原是小分子，分子量一般小于1000，只有反应原性而无免疫原性， 不能直接刺激机体产生免疫应答。因此，需要在保留半抗原抗原决定簇的 基础上，将其改造成大分子，才能获得完全抗原。
半抗原改造一般是将其与大分子物质连接。根据连接的性质主要可分 为以下两种：
物理法连接：颗粒和其它大分子载体，如金标颗粒等
IgG、IgD、IgE：单体 IgA：二聚体、三聚体、四聚体 IgM：五聚体
IgG
wk.baidu.com
IgE
IgA：二聚体
IgM：五聚体
3.3 抗体制备流程图-----多克隆抗体
免疫原＋佐剂（福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂）
免疫动物 血清收取 Elisa效价测定
效价不达标
效价达标
血清收集与纯化
3.3 抗体制备流程图-----单克隆抗体
物
2.5 抗原的制备－天然抗原
颗粒抗原：包括人、动植物、微生物和寄生虫的细胞或细胞的组成结构
物 （壁、膜、鞭毛）。
制备过程：
收集含有目标抗原细胞的 组织，或通过细胞培养等
方法扩增细胞的数量
离心或过滤收集细胞或 者细胞的组成结构物
可溶性抗原：蛋白质、多糖、细菌毒素等，可存在细胞内，或胞外。
胞外：收集胞外分泌液或细胞培养液，然后进行分离、提取和纯化。
氯甲酸异丁酯法（肽键）： 利用半抗原的氨基(或羧基)与载体的羧基（或氨基）联接。
Hapten－COOH＋Cl－COO－CH2CH(CH3)2
Hapten－COO－COO－CH2CH(CH3)2
蛋白－CO－NH－ Hapten ＋
HO－CH2 CH2CH(CH3)2
＋ 蛋白－NH2
2.6 半抗原修饰---连接效果鉴定
主要是免除了烦琐的样品前处理，适用于大量样品筛选、分析。 仪器简单 应用广泛
1.4. ELISA 技术流程图：
抗原合成与鉴定
半抗原修饰 半抗原与载体偶联
人工抗原鉴定
抗体制备
动物免疫 多克隆抗体制备 单克隆抗体制备
ELISA方法建立
基本原理 分类
操作流程
第二节 抗原合成
2.1. 基本概念：
（1）抗原：能够刺激机体产生免疫反应的，一切具有抗原性的物质。 （2）抗原决定簇：指位于抗原分子表面或其它部位的具有一定组成和结构的 特殊化学基团，它能与免疫系统中的淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结 合。 多数天然抗原具有多个抗原决定族，不同的抗原其抗原决定族不同，也 有共同抗原决定族的现象－交叉反应的原因。
如下图所示：半抗原（二率甲喹啉酸，Q)的最大特征吸收峰在210nm左右， 载体蛋白（BSA）在235nm和280nm各有一个特征吸收峰，偶联产物(Q-BSA） 特征吸收峰出现在245nm左右（ Q 与BSA特征吸收峰之间）且在280nm附近出 现了蛋白质的特征吸收峰，故而可初步判定偶联成功。
单克隆抗体（Monoclonal antibody）：抗原通常是由多个抗原决定簇组成的， 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体.
杂交瘤细胞（Hybridoma）：是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B 细胞融合而成的细胞，同时保持B细胞抗体分泌功能和骨髓瘤细胞可在体外无 限增殖两种特征。
Bt抗原免疫小鼠
取出小鼠脾细胞
二氧化硅吸附
纯化的抗体
辛酸－硫 酸胺沉淀
杂交瘤细胞注入小鼠腹腔生长，
腹水含有大量单抗
测定阳性孔、分离 产生Bt抗体的细胞
在培养瓶中 培养杂交瘤细胞
融合
骨髓瘤细胞
HAT培养基中选择培养 只有杂交瘤细胞能生长
第四节 ELISA方法的建立
4.1 ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标 记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测 定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的 抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗 体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标 本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物 被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接 相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催 化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到 很高的敏感度。
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
碳化二亚胺法： 利用半抗原的氨基(或羧基)与载体的羧基（或氨基）联接
蛋白－COO－＋R－NH－CN－R’
+ HNR
蛋白－COO－C－NH－R’
蛋白－CO－NH－ Hapten ＋
R－NH－CO－NH－R’
＋ Hapten －NH2
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
测抗体时：标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标 本中抗体含量愈多，结合在固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。测 抗原与测抗体模式类似，小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
化学法偶联：一般选取蛋白质（载体蛋白）、多肽聚合等载体。半抗原 结构中含有羧基或者氨基的可直接与载体蛋白偶联，若不含有，则需要对 半抗原进行结构改造，引入羧基或氨基后，再与载体蛋白等偶联。此法应 用最为广泛。
2.6 半抗原修饰---活性基团引入
① 含有羟基：琥珀酸酐法
CH2
Hapten CH2OH ＋
4.2 ELISA的种类及其操作方法
A: 双抗体夹心法 B: 间接法 C: 直接法 D:捕获法测抗体 E:亲和素-生物素法
A: 双抗体夹心法
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原（如蛋白质 等），但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点 夹心。即可测抗原，亦可测抗体。
双抗体夹心法侧抗原---反应示意图
OH
+HOOC-C6H10-N=N+
HAPTEN
④ 含有酚基：氯乙酸钠法
HOOC-C6H10-NH2+NaNO2
OH
+ Cl-CH2COONa
HOOC-C6H10-N=N+
HAPTEN
2.6 半抗原修饰－载体种类与性质
蛋白质载体：免疫性强，易联接
常用载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白 (KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。这些蛋白质 分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基 （等电点为7）、羧基（等电点2～4，大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ羧基）等在等电点pH条件下，一部分成为质子，另一部分未质子化的亲核基 团则具有反应活性，可与半抗原中的对应基团结合。
1
概述
2
抗原合成
3
抗体制备
4
ELISA检测方法建立
第一节 概 述
1.1 .简介
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报 道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫 吸附测定法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 。它是继免疫荧光 和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世 以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
颗粒载体，如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、活性炭等；
其它大分子载体：淀粉核/、硫酸葡聚糖
2.6 半抗原修饰---半抗原与载体蛋白质的连接
戊二醛法： 利用半抗原的氨基与载体的氨基联接。
Hapten－NH3 ＋H3N-蛋白＋OHC－CH2－CH2－CH2－CHO
Hapten－N＝C－CH2－CH2－CH2－C＝N-蛋白
灵敏度高： 通常生化分析的最小检出值可达到10－3－10－6g水平，而免疫分析最小检
出值可达到10－9－10－12g水平， 近年来检测方法的灵敏度向着10－15g发展， 比一般生化分析提高1000－1000,000倍。 特异性：
由于抗原抗体反应的高度特异性，免疫分析具有很强的特异性。一种物 质(如激素)的免疫分析能辨别区分结构非常相似的物质。 操作简便：
（二氯甲喹啉酸）
第三节 抗体的制备
3.1 基本概念
抗体:由抗原刺激机体而产生的特异性球蛋白，如免疫球蛋白或抗血清等。
抗体效价（Titer）：又称抗体滴度，是在一定条件下，抗体经系列稀释后与 定量的抗原反应，以能检测出抗体存在的最大稀释倍数。
多克隆抗体（ Polyclonal antibody ）：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。
2.2. 抗原特性：
(1) 免疫原性：能够诱导机体产生抗体或形成免疫回答反应的特性。
(2) 反应原性：能够与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性。
(3) 特 异 性：由特异的抗原决定族决定，一种抗原只能诱发一种特异的免疫 应答，产生特异的抗体或致敏淋巴细胞，且只能与与其诱导产生的 抗体或致敏淋巴细胞发生反应。
抗体滴度曲线：选定一定量的标记抗原于不同稀释度的抗体，在4℃下作用一 定时间后，用分离剂分离抗原抗体复合物，并计算结合的百分率，以其为纵坐 标，以相应的抗体稀释度作横坐标，所得曲线为抗体滴度曲线，选取50％ 结合 率时抗体稀释倍数作为工作液。
3.2抗体种类与结构
抗体分为5大类：IgA、IgG、IgM、IgE、IgD 抗体结构：
牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清清白蛋白（OVA）分子中含有大量的赖 氨酸，故有许多自由氨基存在，且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解 度。此外，这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时，其 活性基团仍呈可溶状态，因此，这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质。
近年来，有研究报道用人工合成的多聚肽(如PLL)作载体，能增加半抗原 的免疫原性，从而使产生特异性抗体的可能性增加，被广泛应用。
CH2
CO O
CO
Hapten CH2 OOC CH2 CH2 COOH
② 含有酮基：O－（羧甲基）羟胺法
Hapten－C=O +H2N-O-CH2-COOH Hapten －C=N-O-CH2-COOH
2.6 半抗原修饰---活性基团引入
③ 含有酚基：重氮化的对氨基苯甲酸法
HOOC-C6H10-NH2+NaNO2HOOC-C6H10-N=N+
间接法测抗原---反应示意图
C: 竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可 用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与 固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳 性反应呈色浅于阴性反应。此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于 测定抗体 。
2.3. 构成抗原的基本条件
1) 异物性：即不是机体正常组织成分。 2) 化学性：分子量大，分子有一定的特殊化学结构。 3) 完整性：完整地进入免疫活性细胞所在的场所。
2.4 抗原的基本类型
1）天然（半）抗原：天然的生物、细胞及天然产物-颗粒抗原和可溶性抗原 2）人工抗原：人工化学改造后的抗原 3）合成抗原：经过化学合成的具有抗原性质的分子，主要是氨基酸的聚合
胞内：细胞破碎、释放抗原，然后进行分离、提取和纯化。
2.5 蛋白质抗原分离与纯化－细胞的破碎
SDS-PAGE
机械破碎
鉴定
细胞破碎
研磨 超声
干燥
非机械破碎
硫酸铵盐析法
纯化与浓缩
胞溶作用
聚乙二醇沉淀法
粗纯
冷冻干燥 真空干燥 酶溶法 化学渗透
有机溶剂沉淀法
精制
离子交换色谱
凝胶色谱
亲和色谱
吸附色谱
2.6 半抗原修饰
B: 间接法
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检 测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法的优点是只要变换包 被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的 关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果， 但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
第一节 概 述
1.2.基本原理
免疫分析是建立在标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)与限量的特异抗体(Ab) 的竞争结合反应，这种竞争作用构成了免疫分析的理论基础 。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
1.3. 免疫分析特点：
半抗原是小分子，分子量一般小于1000，只有反应原性而无免疫原性， 不能直接刺激机体产生免疫应答。因此，需要在保留半抗原抗原决定簇的 基础上，将其改造成大分子，才能获得完全抗原。
半抗原改造一般是将其与大分子物质连接。根据连接的性质主要可分 为以下两种：
物理法连接：颗粒和其它大分子载体，如金标颗粒等
IgG、IgD、IgE：单体 IgA：二聚体、三聚体、四聚体 IgM：五聚体
IgG
wk.baidu.com
IgE
IgA：二聚体
IgM：五聚体
3.3 抗体制备流程图-----多克隆抗体
免疫原＋佐剂（福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂）
免疫动物 血清收取 Elisa效价测定
效价不达标
效价达标
血清收集与纯化
3.3 抗体制备流程图-----单克隆抗体
物
2.5 抗原的制备－天然抗原
颗粒抗原：包括人、动植物、微生物和寄生虫的细胞或细胞的组成结构
物 （壁、膜、鞭毛）。
制备过程：
收集含有目标抗原细胞的 组织，或通过细胞培养等
方法扩增细胞的数量
离心或过滤收集细胞或 者细胞的组成结构物
可溶性抗原：蛋白质、多糖、细菌毒素等，可存在细胞内，或胞外。
胞外：收集胞外分泌液或细胞培养液，然后进行分离、提取和纯化。
氯甲酸异丁酯法（肽键）： 利用半抗原的氨基(或羧基)与载体的羧基（或氨基）联接。
Hapten－COOH＋Cl－COO－CH2CH(CH3)2
Hapten－COO－COO－CH2CH(CH3)2
蛋白－CO－NH－ Hapten ＋
HO－CH2 CH2CH(CH3)2
＋ 蛋白－NH2
2.6 半抗原修饰---连接效果鉴定
主要是免除了烦琐的样品前处理，适用于大量样品筛选、分析。 仪器简单 应用广泛
1.4. ELISA 技术流程图：
抗原合成与鉴定
半抗原修饰 半抗原与载体偶联
人工抗原鉴定
抗体制备
动物免疫 多克隆抗体制备 单克隆抗体制备
ELISA方法建立
基本原理 分类
操作流程
第二节 抗原合成
2.1. 基本概念：
（1）抗原：能够刺激机体产生免疫反应的，一切具有抗原性的物质。 （2）抗原决定簇：指位于抗原分子表面或其它部位的具有一定组成和结构的 特殊化学基团，它能与免疫系统中的淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结 合。 多数天然抗原具有多个抗原决定族，不同的抗原其抗原决定族不同，也 有共同抗原决定族的现象－交叉反应的原因。