甾类激素药物的生产

黑根霉
CH3 C O HO
Rhizopus Nigricans ATCC 62276
O
O

新月弯孢霉（Curvularoa lunata）能将 Reichstein S化合物（简称化合物S， Compound S）一步转化成氢化可的松
CH2OH C O
CH2OH HO
新月弯孢霉
C O OH
O
化合物S
工业上通过生物技术来控制微生物选择性地 降解甾体边链以获得甾类药物的前体物。
生物技术控制途径
① 通过底物-甾体结构的修饰； ② 在微生物降解过程中加酶抑制剂； ③ 通过诱变技术获得生化阻断突变菌株。
甾体激素 的生产工艺过程

甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生 素的生产不同 发酵的产物不是目的产物，而只是利用微 生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定 的化学反应来获得一定的产物。

发酵：将玉米浆、酵母膏、硫酸铵、葡萄 糖及水投入发酵罐中搅拌，用氢氧化钠溶 液调整物料pH值到5.7～6.3，加入0.03%豆 油，灭菌温度120℃，通入无菌空气，降温 至27～28℃，接入犁头霉孢子悬浮液，维 持罐压0.6kg/cm2，控制排气量，通气搅拌 发酵28～32小时。用氢氧化钠溶液调pH值 到5.5～6.0

甾体上羟化对化学合成而言是非常困难的， 除了C17位上通过化学方法能导入羟基外， 其它位置很难导入。
通过微生物羟化酶能非常专一地选择某个 碳位置上将某空间位置上的氢取代氧化成 原来空间构型的羟基。


如孕酮的转化中，利用黑根霉在温度不超 过320C时成功地实现了C11α羟基化反应。
CH3 C O
适宜的发酵条件主要包括



（1）搅拌 搅拌可增加传质和传热，可以增加培 养基的氧气供给，使氧气均匀分散而提高转化率。 （2）通气 可直接增加氧气的供给。有研究表明， 溶解氧量对诱导酶产生非常重要。 （3）前体半连续的加入 可以降低由于一次大量 加入所引起的毒性，也可减少由于发泡所引起前 体的损失。


投入底物氧化：发酵液体积0.15%的莱氏化合物S， 氧化48小时后，取样作比色试验检查反应终点。 提取：到达终点后滤除菌丝，滤液用树脂吸附， 然后用乙醇洗脱，洗脱液经减压浓缩至适量，冷 却到0～10℃，过滤、干燥得到粗品，熔点195℃， 收率46%左右 或用醋酸丁酯多次提取，合并提取液，减压浓缩 之适量，冷至0～10℃，过滤、干燥得粗品，熔点 为195℃，收率为46%左右


生产过程

微生物生长和甾体的转化完全可以分开：
一般先进行菌的培养，在菌生长过程中累 积甾体转化所需要的酶


然后利用这些酶来改造分子的某一部位。
一、甾体的微生物转化生产流程
培养基 培养菌 液 离心 氧化甾体
（甲）
菌种
甾体基质
菌体
培养基
甾体基质 甾体的溶液（有机 溶剂） 或悬浮液（缓冲） 液）
氧化甾 体
3、混合培养进行反应是将具有1，2脱氢能力 和11β-羟化能力的微生物并用进行转化反 应。
（如果两种微生物单独培养，则必须将各过 程中的抽提产物转送到下面的工序，人力 物力消耗较大。如采用混合培养法，则可 省略抽提操作。）
影响转化的一般因素

生物转化的关键： 选择专属性高的微生物 控制适宜的发酵条件

精制：用有机溶剂重结晶法进行精制 用16倍左右的甲醇或乙醇重结晶，即可以 得到精制的氢化可的松，熔点212℃以上
存在的问题

生物转化反应的转化率较低，投料浓度亦 低，氧化的专属性不够理想，是氢化可的 松生产中存在的问题，有待于进一步研究。 国外在氢化可的松的生产中，用新月弯孢 霉在玉米浆培养基中将化合物S直接转化成 氢化可的松，11β-OH转化率可以达到65～ 75%，大大高于用犁头霉菌的转化率50%。
3、天然提取
微生物转化工艺的特点

① 可减少化学合成步骤，简化生产流程， 缩短生产路线。 如由黄体酮生产炔诺酮，利用微生物转 化，可以减少6步工序。
② 能提高产物的收率和产品质量，降低成本。 不同的菌种都会影响到产品的收率和成本， 菌种越优良，反应越向有利的方向进行。 采用生物转化，减少了生产步骤，从而也 降低了过程损失。 如19-羟基-4-雄烯-3，17-二酮转化为雌酮 采用化学法合成需要3步才能完成，产品得 率只有15%~20%， 采用微生物转化法，得率可达到80%以上。
（乙）
甾体微生物转化的两个阶段

第一阶段：微生物生长阶段
第二阶段：底物转化阶段

第一阶段：微生物生长阶段

它是将菌种接入斜面培养基或小米培养基 培养3～5d→将成熟的菌种细胞或孢子接入 摇瓶或种子罐，给予合适的温度、溶氧浓 度、pH值等条件培养，使其充分繁殖与生 长。培养时间的长短随菌种和环境而异， 细菌的生长期12～24h，真菌为24～72h。


由于生物氧化所用的菌种梨头酶菌的专属性不够 理想，成品中除氢化可的松（简称β体）外，还 生产11α-羟基化合物及表氢可的松（简称α体）， 以及少量其它位置的羟基化合物和未转化的化合 物S 所以在霉菌氧化反应后，用醋酸丁酯提取到它的 粗品中，就有以上各种副产物，必须分离提纯。
分离原理：采用混合溶剂法进行分离，利用它们在 甲醇-氯乙烷混和溶剂中溶解度的不同（α体溶解 度较大，β体较小）而达到分离目的。 分离方法：粗品中主要为β体，并混有部分α体， 必须要分离精制，可以将粗品加入16～18倍含8% 甲醇的二氯乙烷溶液中，加热回流使全溶，趁热 过滤，滤液冷却至0～50C，冷冻、结晶、过滤、 干燥得氢化可的松
四、甾核及边链的选择性降解机理
具有生理活性甾体类药物的基本母核目前 都是从高等动植物中获得 首先必须有选择性地对其边链进行降解。 化学法选择性差，产率低。目前，多采用 微生物转化法。



甾体药物的天然资源



薯蓣皂苷元（约占60%） 豆甾醇（约占15%） 胆甾醇 β-谷甾醇
甾核边链的选择性降解的应用

氢化可的松的制备

氢化可的松（Hydrocortisone）又称为皮 质醇，化学名称为11β，17α，21-三羟基 孕甾-4-烯-1，20-二酮。其结构式为
CH2OH CO HO OH
O
氢化可的松的性状

为白色或几乎白色的结晶性粉末，无臭， 初无味，随后有持续的苦味，遇光逐渐变 质，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿，在 乙醚中几乎不溶，不溶于水。熔点为212～ 222℃比旋光度为+162～1690（1%乙醇）。
微生物转化 生产甾体药物的工艺

一般采用二级培养 工艺流程如下：
孢子制备
滤液 过滤 滤饼 溶媒萃取
投入底物 种子制备 发酵
菌种
结晶
二、甾体微生物转化方式
1、由生长菌体培养物进行的反应是在培养菌体的适 当时间（中期或后期），添加基质，一边继续培 养，一边进行反应。
2、由静态菌体悬液进行的反应是在适当的培养基中， 使菌体充分生长发育后，用过滤或离心法进行分 离，将收集到的菌体悬浮在水或适当的缓冲液中， 再将甾类化合物加入进去，使其反应。
四、产物的分析与分离方法

产物的分析与分离均需要用适当的与水不 混溶的溶剂将甾体从培养基中提取出来， 最常用的如：氯仿、二氯乙烷、醋酸乙酯 和甲基异丁基酮等。
溶剂的用量需根据产物在培养基和溶剂中 的分配系数而定，提取时要防止乳化。产 物的提取液经适当的浓缩，用柱层析或直 接用分步结晶的办法可以得到产物。
O
氢化可的松
二、环氧化反应


用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基 团的反应与微生物羟基化有关。 能产生11β-羟基化的新月弯孢霉或布氏小 克汉银霉都可将17α，21-二羟基-4，9 （11）-孕甾二烯-3，20-二酮转化成9β， 11β环氧化合物。
三、脱氢反应


当抗炎甾体激素等药物的母核C1，C2位置导 入双键后，其抗炎作用会成倍增加。 醋酸可的松C1，C2位上导入双键成醋酸脱氢 可的松后抗炎作用增强3～4倍。
2、工艺过程


种子培养：将梨头霉菌接种到土豆斜面培 养基，28℃培养7～9d，成熟孢子用无菌 生理盐水制成孢子悬液后。 种子培养的条件：培养基为葡萄糖、玉米 浆、硫酸铵等配制，pH为5.8～6.3，接入 孢子悬液后，在通气搅拌下28℃培养 28~32h。待培养液菌浓度达到35%以上， 无杂菌污染，即可转入发酵罐。

（4）培养基组成 ①氮源规格影响不太大，水解蛋白比蛋白 胨好；②糖类和脂肪对11β羟化有影响； ③有些酶反应需要金属离子，例如缺锌不 能进行6β-羟化，而有些金属离子使酶失 活。

（5）温度：微生物的培养都有适宜的温度， 若温度太低，微生物生长不良，不能产生 足够的酶；若温度过高，又会因酶蛋白变 性而使转化反应受阻。

1、反应原理
生物氧化与水解

这一步反应是利用梨头霉菌，引入11β-羟 基。在产物中，除了氢化可的松（简称β 体）（Ⅱ）外，还产生11α-羟基化合物即 表氢可的松（又称为α体）（Ⅲ）、少量 的其它位置的羟基化合物和未转化的化合 物S（Ⅰ）。所以在产品的分离纯化时，以 上各种物质必须分离出去。
工艺流程图
氢化可的松的工业生产

甾体药物的合成基本上是用半合成方法合成的， 仅有及少数用全合成制备（如甲基炔诺酮），
原因是全合成的工艺路线过长（如可的松需三十 余步反应），反应特殊，工艺过程过于繁杂；总 收率低，无工业生产的价值。

目前国内外大都采用半合成的工艺 路线，即从天然药物中取得含有甾 体基本骨架的化合物为原料通过化 学合成来制取甾体药物。 氢化可的松采用半合成法生产。 七步合成制得醋酸化合物S，然后经 生物转化制得氢化可的松。