免疫组化(DAB试剂盒标准)
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
普罗安蒂生物科技增强型DAB显色试剂盒说明书
陕西普罗安蒂生物科技发展有限公司增强型DAB显色试剂盒说明书产品简介：本试剂盒适用于辣根过氧化物酶（HRP）检测系统的免疫组化染色，也可用于western blot等实验。
产品组成：10xDAB浓缩液3MLDAB缓冲液60ML使用方法：1-对于组织切片或细胞样品或膜，在与HRP标记的抗体或其他形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min。
对于检测内源性HRP的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min。
2-10XDAB浓缩液：DAB缓冲液=1:10配置，得DAB工作液。
取1mL DAB 缓冲液，100ul 10xDAB浓缩液混匀后即为DAB显色工作液。
3-最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。
4-室温避光孵育3-10min，或在显微镜下根据颜色深度自行掌握反应时间，染色结果为棕色。
染色结束后，去除反应液，用双蒸水清洗2-3次即可。
注意事项：（1）本产品需避光保存，混合好的工作液30min内有效。
（2）使用时请做好防护，如果不慎将试剂沾染到眼睛、皮肤上，请立即用大量清水冲洗。
（3）本产品仅做科研用途。
贮存条件：-20℃避光保存。
常见问题：1-背景显色太深a-在IHC如果背景显色太深，一方面须考虑使用适当的封闭液进行封闭，使用和一抗相同来源的血清（10%）进行封闭。
另一方面，请选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。
b-在IHC如果背景显色太深,需注意灭活内源性过氧化氢酶，可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。
c-可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度，另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间也会有所帮助。
2-没有显色或显色太弱a-可以考虑适当提高一抗或二抗的浓度，检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。
b-可以考虑使用更加灵敏度的放大体系，例如使用生物素检测体系。
immunoway cd141 免疫组化检测试剂盒 说明书
CD141免疫组化检测试剂盒【产品货号】 IHCM6830【产品名称】1、通用名称：CD141 mouse mAb ABT145免疫组化检测试剂盒2、英文名称：CD141 High Sensitive and Rapid Immunohistochemical Kit【主要组成成份】 编号名称规格 保存试剂 9A 脱蜡修复二合一溶液20X 60 mL 2~8°C 试剂 B 过氧化物酶封闭缓冲液 3 mL 2~8°C 试剂 C HRP 多聚合抗兔/鼠二抗 3 mL 2~8°C 试剂 D 超敏DAB 浓缩液20X 150μL 2~8°C 试剂 E 超敏DAB 缓冲液 3 mL 2~8°C 试剂 F 苏木精染色缓冲液 3 mL 2~8°C 试剂 G即用型抗体溶液3 mL2~8°C【预期用途】免疫组织化学染色。
【作用原理】超敏快速免疫组化检测试剂盒，摆脱传统免疫组化实验条件对实验的限制和束缚，无需通风厨和传统的脱蜡修复缸，将传统的三次二甲苯脱蜡、三到五次梯度乙醇水化和抗原修复整合成一个溶液，有效的缩短了操作时间，简化了繁琐的操作步骤，同时，减少了操作中的变量，提高了染色的稳定性。
脱蜡抗原修复二合一试剂应用新的环保技术，不仅把对身体的危害降到了最低，而且对环境不会造成任何污染。
免疫组化实验用到的试剂一站式配齐，具有高灵敏度的 HRP 多聚合物二抗(Anti-Rabbit/Mouse)和 D AB 显色液配套使用，使得该试剂盒具有操作方便、快速、灵敏度高等特点。
【包装规格】3mL 装。
标准可染色30张切片。
【储存条件及有效期】1、储存要求：2℃～8℃密封保存。
2、有效期：一年。
【适用仪器】 手工操作【自备材料】 1、 合适的加热装置，染缸，移液器，盖玻片等常用耗材2、 无水酒精3、 中性树胶4、 PBS 、纯水等常用试剂 【样本要求】新鲜活检或外科样本组织，甲醛固定，固定时间8-24小时要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块。
免疫组化(DAB试剂盒标准)
免疫组织化学技术一，流程图：二，详细操作：（一）制作石蜡切片（详见后面的材料）（二）脱蜡，透明，水化1）脱蜡前先60度烘片30-40min;2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3缸），各15min。
注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本3）梯度乙醇入水：将切片依次置入100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各5min;（三）抗原修复操作：1）6min45s烧开修复液(柠檬酸0.2g+柠檬酸三钠 1.5g蒸馏水稀释至500mL,PH为6.0)2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟3）将修复液1min20s再烧开4）组织再焖5分钟5）取出烧杯，使液体和组织自然冷却6）PBS冲洗3分钟1次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜)，PBS 冲洗3分钟1次（四）孵育操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢10min，PBS冲洗3分钟x3次；2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35ul山羊血清，室温下孵育30分钟（注意：此步操作后不用PBS冲洗）；3）加一抗(PCNA兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好）2h，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30—40min，复温也要放在湿盒内4）加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG复合物）：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；5）加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；（五）显色1）DAB染色：每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液，室温孵育10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。
2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min（还可以浸泡10min的纯水）3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干，观察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面）备注：1、PBS配制：团队常用一包PBS粉末，配制2000ml纯水，加6ml 的NAOH，PH在7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的NAOH 或者酸量不同，但是PH一般是一样的）2、一抗工作液，一般配制成5ml，0.3%的牛血清（0.15g），5%的羊血清（250ul），余加纯水3、一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的4、DAB：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的部分，防止误差5、用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完。
免疫组化步骤
免疫组化实验报告及流程试剂：即用型免疫组化Elivision plus 试剂盒（鼠|兔）（迈新KIT-9901）（迈新KIT-9902）二抗批号1203209901效期201301120502405C 效期201304试剂A：增加剂试剂B：酶标羊抗鼠兔抗IgG聚合物DAB显色试剂盒（迈新KIT 0031）溶液：蒸馏水、（PH7.25~7.35）、柠檬酸（PH6.0）、乙醇（无水、95%、85%、75%）、二甲苯、双氧水、苏木素等溶液配制：1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC1 37mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2. 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3. 3%蒸馏水或甲醇H2O2溶液，用30%H2O2和蒸馏水或甲醇溶液配制。
仪器：移液器、微波炉、微波修复盒、玻璃器皿等。
流程简介样本来源：迈新阳性片抗体（简称）：CD34 (兔源)浓度选用：CD34 1:200免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡至水，二甲苯（两缸5min、5min）、梯度酒精（无水、95%、85%、75%）每缸5min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
2.微波修复，高火2~3min，中火5min，低火5min，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次三分钟3.3%双氧水阻断内源性过氧化物酶室温（18~30度）10~30min。
PBS冲洗3次，每次三分钟。
4.5%BSA孵育30min5.滴加一抗（客户自选），4度过夜。
PBS冲洗3次，每次三分钟。
6.除去PBS，每张切片滴加50ul聚合物增加剂A,室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
7.除去PBS，每张切片滴加50ul试剂B酶标羊抗鼠兔抗IgG聚合物，室温孵育30min，PBS冲洗3次，每次三分钟。
8.除去PBS，每张切片滴加50ul新鲜配制的DAB,镜下观察。
2022年免疫组化评分-前列腺癌免疫组化评分标准
免疫组化试剂1 10XPBS 80g Nacl, 2g Kcl, 14.4g Na2HPO4, 2.4g KH2Po4,力口水至IL,调pH至7.42 漂洗液lXPBS+0.1%Tween-20（2ml 50%Tween-20）3lOmM柠檬酸钠溶液：2.94g柠檬酸三钠钠二水合物£6出^3。
7.2或0）加于1L水中，调pH至6.043%H2O2,用30%出。
2稀释（4℃避光保存）5 封闭液-10%山羊(goat)血清血清溶于PBST,稀释10倍。
步骤：1.脱蜡/脱二甲苯(提示：在此过程中任何时候都不能干片)1.1二甲苯15min1.2二甲苯25min1.3二甲苯35min1.4第一次无水乙醇5min1.5第二次无水乙醉5min1.695% 乙醇5min1.7自来水洗2次，5min/次.3%H2O 浸泡lOmin置于PBST洗片5min.抗原修复10mM柠檬酸钠95℃ 15min,在室温放凉，PBST洗片5imn.2.封闭4.1100-400ul 10%goat 血清室温封闭lh2.1PBST洗片,滴加100-4003一抗（用封闭液稀释）一抗浓度1:400/1:1000, 室温孵育lh或4c过夜2.2回收一抗，PBST洗片3次,5min/次2.3滴加100-4003二抗（用10%goat血清稀释1:200稀释）,室温30min2.4除去二抗，用PBST洗片3次，5min/次2.5滴加三抗,2滴/片，室温30min （三抗:5ml PBST, 2滴Reagent A, 2滴Reagent B）2.6除去三抗，用PBST洗片3次，5min/次2.7滴加100-400DAB 于片上（DAB:2.5ml 0.1%Tween 水，1 滴或50ul Buffer, 1 滴或50ul过氧化物试剂，2滴或1003 DAB,每加一次需混匀）2.8立即镜检，约染lmin2.9浸泡于PBST中.苏木精复染2.10苏木精染色lmin2.11自来水冲洗2次2.12脱水（注意:不要让二甲苯挥发干）2.13脱乙醇.树脂封片（黄枪头剪粗开口）3.过夜晾干。
免疫组化试剂盒说明书
(HopeBiot) 镇江厚普生物科技有限公司Zhenjiang Hope Biotechnology Co.，Ltd订货电话：*************传 真：*************网 站：http:// E-mail ：*******************Histostain-Plus Kits免疫组化染色试剂盒货号：SP-9002简介: 本试剂盒为美国ZYMED 公司SP 系列试剂盒，全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase ）染色试剂盒。
由美国ZYMED 公司于1986年首建。
由于链霉卵白素的分子量是60kDa ，有四个亚基和生物素结合，等电点为6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点，是理想的免疫组化染色方法。
包装：试剂（无色液体）： 3％ H 2O 2去离子水， 6ml ；试剂A （蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液， 6ml ；试剂B （黄色液体）：生物素化山羊抗小鼠IgG 二抗工作液， 6ml ；试剂C （橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP ），6ml 。
标本染色步骤：1， 石蜡切片，常规脱蜡至水。
2， 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5分。
（如需采用抗原修复，在此步骤后进行） 3， 3％ H 2O 2去离子水（无色液体）孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
4， 滴加试剂A （蓝色液体）室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。
5， 滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2-3小时或4℃过夜。
6， PBS 冲洗，3分钟×3次。
7， 滴加试剂B （黄色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。
8， PBS 冲洗，3分钟×3次。
9， 滴加试剂C （橙色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。
10，PBS 冲洗，3分钟×3次。
11，显色剂显色DAB 。
12，自来水充分冲洗。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置
免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置问题：免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置？参考见解1：阳性对照：已知含有要测的抗原的组织。
阴性对照：可以做几种：空白对照：免去一抗代替对照：免疫前血清代替一抗已知阴性组织抑制试验：未标记抗体要发文章建议做代替对照。
参考见解2：楼上回答的真好，不过组织内对照的合理使用可以免去设置实验对照的很多麻烦！问题：免疫组化技术(IHC)的优点是什么参考见解：1．特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2．敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3．定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。
免疫组化常见问题的处理参考意见：当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
免疫显色试剂说明书
免疫显色试剂说明书【产品名称】免疫显色试剂【包装规格】【预期用途】在免疫组化反应或原位杂交反应中与首要抗原抗体结合，通过染色，将靶点进行标记。
【检测原理】免疫显色试剂是二步法免疫组化试剂盒，适合与兔或鼠源一抗配用。
其主要过程为，一抗与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物与抗原抗体复合物中的一抗结合，再利用辣根过氧化物酶催化二氨基联苯胺（DAB）在抗原部位形成棕色显色。
由于该系统不含生物素和链亲和素，所以不受内源性生物素干扰，染色背景非常清晰。
【主要组成成分】其他需要但未提供的材料：PBST缓冲液（pH7.2-7.4）、纯化水、酒精、脱蜡液、苏木素染色液、中性树胶、塑料湿盒、染色缸、染色架等。
【储存条件及有效期】储存条件：2-8℃，有效期18个月。
请在开瓶3个月内使用。
生产日期、有效期至：见标签。
【样本要求】常规经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。
【检测方法】常规脱蜡水化：石蜡切片经常规脱蜡和水化。
抗原热修复：参照一抗说明书进行抗原修复。
DAB工作液的配制：按每毫升DAB缓冲液（试剂D）中加入50μL DAB色原（试剂C）（约1滴）的比例配制DAB工作液，DAB工作液应现配现用。
配制好的DAB 工作液需在2小时内使用，如出现沉淀，使用前先混匀。
操作步骤：1）抗原修复完毕后自然冷却的切片，用自来水清洗。
2）除去切片上组织周围的液体，用免疫组化笔圈定玻片上的待测组织区域并放入PBST缓冲液中。
3）取出切片，除去PBST缓冲液，滴加内源性过氧化物酶阻断剂（试剂A）（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上孵育10分钟，用PBST清洗切片。
4）除去PBST缓冲液，滴加100μL左右一抗工作液（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上进行孵育（按照各自一抗说明书操作）。
一抗孵育完毕，用PBST清洗切片。
5）除去PBST缓冲液，每张切片加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（试剂B）100μL左右（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），室温下孵育30分钟。
Elabscience 二步法免疫组化试剂盒说明书
E-mail:Website: 2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/Mouse IgG Detection SystemCat. No: E-IR-R211Size: 3 mL/ 6 mL/ 18 mL产品编号产品名称 3 mL 6 mL 18 mL Storage E-IR-R211A 3% H2O2 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211B Polymer Helper (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°CE-IR-R211C Polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG (Ready-to-Use) 3 mL 6 mL 18 mL 2~8°C说明书一份产品简介Elabscience 公司最新推出的二步法免疫组化试剂盒，将二抗的单价Fab 片段和过氧化物酶HRP 聚合在一起，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，既保留了抗体特异性结合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子过大而造成的空间位阻。
与传统的SP三步法相比，此试剂盒具有简单、快速、敏感等特点，试剂盒不再使用生物素，避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。
本产品可用于检测一抗是Rabbit和Mouse来源的单克隆抗体或多克隆抗体，本品独特的聚合物辅助剂有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子。
此检测系统是目前已知的灵敏度最高的免疫组化检测系统。
使用说明1.脱蜡、水化组织切片。
2.根据所应用的抗原抗体要求，对组织切片进行抗原修复。
3.加E-IR-R211A 3% H2O2，孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
4.PBS或TBS 冲洗，3分钟×3次。
5.滴加适当稀释的一抗，室温或37°C孵育1~2小时或4°C过夜（后37°C复温30 min），PBS 或TBS冲洗，3分钟×3次。
免疫组化原理及应用
象PAP法那样由抗酶血清制备而成，所以背景着色减少，
敏感性更高。
HRP HRP
ABC法：
HRP biotin
ABC复合物 马抗兔（二抗）
兔抗x（一抗）
⑥S-P法：是在ABC法的基础上进行了改进，第一、第二步
与ABC法相同，在第三步，将链酶卵白素直接与酶耦合在
一起，减少了操作步骤，进一步增加了灵敏度，现被广泛
应用。
HRP
HRP
S-P法：
SA
酶链卵白素
HRP
BT
羊抗鼠IgG（二抗）
BT 鼠抗x（一抗）
（三）具体操作步骤
以S-P法为例：
1. 石蜡切片脱蜡至水；
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可 在此步后进行）；
3. 3活%性H；2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的
4. 5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。 倾去血清勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液， 37℃孵育1-2小时或 4 ℃过夜；
HRP HRP
PAP法：
HRP
兔PAP复合物（三抗）
羊抗兔IgG （二抗）
兔抗 x
（一抗）
⑤ABC法：很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋
白，会引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在
鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68000，称卵白素
（avidin）。一个avidin分子上有4个biotin（生物素）结合
—HRP(FITC)
直接法：
②间接法：也称二步法。第一步用的是不标记的第一抗体， 第二步用标记有酶或荧光素的抗第一抗体同种动物IgG的 抗体。本方法的优点是在检测各种不同抗原时，只要第一 抗体是免疫同一类动物产物的抗体，均可应用相同的第二 抗体，不象直接法那样需对各种抗体逐个标记。此外由于 第一抗体的一个分子作为抗原可结合多个第二抗体分子， 故敏感性较直接法大为提高。
百度文库-DAB显色试剂盒说明书
广州市外显子生物技术有限公司Http//DAB显色试剂盒（20×）说明书货号：S-1503规格：溶液A：10ml溶液B：10ml保存：-20℃避光密闭保存，一年有效，避免反复冻融；短期可2-4℃保存。
产品简介：DAB是过氧化物酶（POD）的显色底物，DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法，适用于辣根过氧化物酶HRP 标记的免疫印记或免疫组化反应。
过氧化物酶催化底物发生反应，于反应部位产生棕色沉淀物，免疫印记可直接在膜上显示条带；免疫组化标本显色时间一般为室温10-15分钟，随后在显微镜下观察显色情况，显色充分后应将标本及时脱水封固，其终产物可直接在光镜下观察。
操作说明：1. 对于组织切片或蛋白质印记膜，在与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5 分钟。
2. 取900μl PBS（或双蒸水），加入50μl溶液A，50μl溶液B 混合均匀，即配成DAB工作液。
如需要更大体积工作液，可按比例放大。
此溶液必须现用现配，配好后避光保存，30min内使用，过期后请将剩余的液体废弃。
Http// 3. 向组织切片或印记膜上加入适量DAB工作液，确保能充分覆盖样品。
4. 室温避光孵育10-15 分钟或更长时间，避免光照，直至显色至预期深浅。
5. 去除DAB染色工作液，用蒸馏水洗涤2-3 次即可终止显色反应。
6. 对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可对其进行其他染料复染。
对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
注意事项：1. DAB溶液应低温密封保存。
如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。
2. 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用。
3. 显色时间严格控制，根据情况调整，以免显色过度。
固相膜显色数小时后即会褪色，不能永久存在。
4. DAB为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
免疫组化dab显色标准
免疫组化dab显色标准
免疫组化（IHC）染色过程中，DAB显色的标准主要包括定性、定量和定位三个方面。
1. 定性判断：根据DAB标记的染色结果，判断为阳性或阴性。
在IHC片上，根据标本抗原多寡会在细胞特定部位由浅到深呈浅黄色-棕黄色-棕褐色粗颗粒。
评分为：0分（阴性，无黄色），1分（阳性，浅黄色），2分（阳性，棕黄色），3分（阳性，棕褐色）。
2. 定量判断：根据阳性细胞的密度进行判断。
在低倍镜下，根据阳性细胞占总细胞数的比例（例如IHC标记阳性肿瘤细胞占所有细胞的比例），≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。
3. 定位判断：根据阳性细胞在组织细胞中的形态、分布进行判断。
以上信息仅供参考，建议查阅免疫组化相关书籍获取更全面和准确的信息。
DAB显色试剂盒说明书
产品说明书 / Specification Sheet辣根过氧化氢酶DAB显色试剂盒产品编号：PW017产品简介：DAB即：二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。
用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好。
是HRP结合物最常用的底物,常在免疫组化,原位杂交,Western blot等膜显色或检测细胞或组织内源性的过氧化物酶中应用广泛。
运输和保存条件：常温下运输，收到后，将溶液A, 溶液C在-20度闭光的环境中保存，反应液2-8度保存，保质期一年。
组成:本试剂是为免疫组化,原位杂交,Western blot等膜显色专门配制的,由反应液,溶液A, 溶液C三部分构成:能够使用5次1: PW017-1 反应液50ml2:PW017-2 溶液A 1 ml3:PW017-3 溶液C 0.12ml使用方法:1:在免疫印迹(western blot)实验中,先将相应的HRP（辣根过氧化氢酶）标记的二抗覆盖膜后,在37度的情况下,于震荡器上,震荡一个半小时左右,再用TBST或者PBST洗涤膜3~4次,最后一次用TBS或PBS洗涤膜,再将膜转移到阴暗处。
2:显色前,先取反应液10 ml在一个15ml的干净棕色瓶子中，再取200ul左右的溶液A和溶液C 20ul形成显色工作液, 加入充分混匀。
3在阴暗处.将显色工作液加入膜上,将膜覆盖, 在37度的情况下,震荡反应十分钟左右即可.这时浅棕色的条带出现。
4倒掉反应液，双蒸水冲洗条带3~4次，自然干燥。
5照像记录实验结果。
注意事项:1: 溶液A在使用之前，37度温育10分钟，以免产生沉淀。
2: 显色时间严格控制，非常小心，一般10分钟左右。
以免造成过度显色，而且显色后数小时将会褪色。
3: 请使用完后，将反应液，溶液A, 溶液C的盖子旋紧,以防止溶液挥发和与空气中的成分发生化学反应。
用于免疫组化检测的DAB显色试剂盒及其应用[发明专利]
![用于免疫组化检测的DAB显色试剂盒及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9f18a340f342336c1eb91a37f111f18583d00c35.png)
(19)国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202110839028.4(22)申请日 2021.07.23(65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 113484313 A(43)申请公布日 2021.10.08(73)专利权人 图凌（杭州）生物医药有限公司地址 310052 浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号5幢1702室(72)发明人 陶娜娜 章月凯 潘丽 (74)专利代理机构 杭州信与义专利代理有限公司 33450专利代理师 万景旺(51)Int.Cl.G01N 21/78(2006.01)G01N 33/58(2006.01)G01N 33/53(2006.01)(56)对比文件US 5225325 A ,1993.07.06CN 110361245 A ,2019.10.22CN 105164272 A ,2015.12.16US 2012077211 A1,2012.03.29CN 109856383 A ,2019.06.07CN 111766385 A ,2020.10.13US 2002164660 A1,2002.11.07CN 111426826 A ,2020.07.17审查员 卞庆娜 (54)发明名称用于免疫组化检测的DAB显色试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于免疫组织化学检测的DAB显色试剂盒，属于免疫组化检测技术领域。
所述DAB显色试剂盒包括DAB缓冲液和DAB色原，所述DAB缓冲液包括咪唑、4‑壬基苯基‑聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA溶液和焦磷酸钠；所述DAB色原包括：1,2‑丙二醇和3,3‑二氨基联苯胺四氯盐水合物，进一步，所述试剂盒还包括DAB增强剂，所述DAB增强剂包括硫酸铜、氧化钠、氧化钾、蔗糖和苯扎氯铵。
本发明进一步公开了所述DAB显色试剂盒的应用。
利用本发明的DAB显色试剂盒进行免疫组化检测，能够显著提高染色强度和灵敏度，并且本发明的DAB显色试剂盒组分简单，易于配制，具有极佳的稳定性。
DAB 染色液说明书
DAB染色液说明书【产品名称】通用名称：DAB染色液英文名称：DAB Staining Sloution(Polymer)【包装规格】货号规格4951011100Test/Kit4951012500Test/Kit【预期用途】本试剂盒可供医疗机构用于免疫组化检测，可与鼠源一抗和靶抗原形成的复合物相结合，对常规经福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的靶抗原进行染色，染色结果适用于在生物显微镜下进行观察。
主要用于免疫组织化学染色的显色。
【检验原理】本试剂盒可检测通用的鼠源一抗，一抗与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，酶标羊抗小鼠IgG聚合物与抗原抗体复合物中的一抗结合。
酶标羊抗小鼠IgG聚合物中的HRP催化二氨基联苯胺（DAB）在抗原部位棕色沉积。
通过光学显微镜观察棕色部位来确定抗原表达情况。
【主要组成】产品组成100Test/Kit500Test/KitA液：内源性过氧化物酶阻断剂10ml/瓶X150ml/瓶X1B液：酶标羊抗小鼠IgG聚合物10ml/瓶X150ml/瓶X1C液：DAB缓冲液10ml/瓶X150ml/瓶X1D液：DAB色原0.6ml/瓶X13ml/瓶X1【产品概述】样本要求福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片；丙酮固定的冷冻切片适用仪器普通光学显微镜自备材料浓缩型或即用型一抗、抗体稀释液、苏木素、中性树胶等储存及有效期2℃~8℃避光保存，有效期12个月，生产日期，失效日期见标签【检验方法】1.烤片：将准备好的组织切片置烤箱中60-65℃烤片1-1.5h。
2.脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10min x2次，沥液后，无水乙醇浸泡5min x2次；沥液后，95%乙醇浸泡5min；沥液后，85%乙醇浸泡5min；自来水冲洗3min x4次。
3.抗原修复：参照一抗说明书进行。
4.阻断内源性过氧化物酶：用免疫组化笔圈定玻片上待测组织区域，PBS缓冲液洗3min x3次。
去除PBS在圈定区域内滴加内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育12min；PBS缓冲液浸洗2min x3次5.封闭：取出切片甩掉多余PBS溶液，滴加封闭液（常用5%羊血清）至组织上，37℃封闭30min。
免疫组化结果判断及常见问题的分析
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
免疫组化标准化照片
CK10 ER CD44v6
合格的免疫组化染色切片 是正确判断染色结果的基础和前提
三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
PCNA
S-P×400 S-P×400
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
无信号片
CD30
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤
对策
改善条件，重取材 确定抗体种属无误 不得使用过期的试剂盒 更换适配的显色系统 严格遵守操作规程
无色或浅色片
MCL理想的 CD5着色。所有的 瘤细胞都着色很强。散在的T细 胞着色比瘤细胞深。
MCL的CD5染色不足 (一抗浓 度太低)。 MCL瘤细胞几乎都 没有着色。
3. 染色过弱原因及其对策
染色过弱原因
抗体浓度过低，孵育时间过短 滴加试剂时缓冲液未沥干 过度蛋白封闭 抗原被破坏
室温太低，<15℃
对策
提高浓度，延长时间
滴加试剂前沥干多余水分
缩短封闭时间
新鲜组织及时固定，固定 时间不要超过24小时 适当延长孵育时间
免疫组化(IHC)标准化
免疫组化（IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。
虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。
免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。
所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。
20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。
当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。
1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。
（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。
对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。
需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。
病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。
由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。
常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。
由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。
应避免使用含重金属的固定剂。
10%中性缓冲福尔马林配制方法：40%甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。
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免疫组织化学技术
一，流程图：
二，详细操作：
（一）制作石蜡切片（详见后面的材料）
（二）脱蜡，透明，水化
1）脱蜡前先60度烘片30-40min;
2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3缸），各15min。
注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本
3）梯度乙醇入水：将切片依次置入100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各5min;
（三）抗原修复
操作：1）6min45s烧开修复液
(柠檬酸0.2g+柠檬酸三钠 1.5g蒸馏水稀释至500mL,PH为6.0)
2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟
3）将修复液1min20s再烧开
4）组织再焖5分钟
5）取出烧杯，使液体和组织自然冷却
6）PBS冲洗3分钟1次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜)，PBS 冲洗3分钟1次
（四）孵育
操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢10min，PBS冲洗3分钟x3次；
2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35ul山羊血清，室温下孵育30分钟（注意：此步操作后不用PBS冲洗）；
3）加一抗(PCNA兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好）2h，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；
加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30—40min，复温也要放在湿盒内
4）加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG复合物）：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；
5）加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；
（五）显色
1）DAB染色：每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液，室温孵育10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。
2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min（还可以浸泡10min的纯水）
3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干，观
察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面）
备注：
1、PBS配制：团队常用一包PBS粉末，配制2000ml纯水，加6ml 的NAOH，PH在7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的NAOH 或者酸量不同，但是PH一般是一样的）
2、一抗工作液，一般配制成5ml，0.3%的牛血清（0.15g），5%的羊血清（250ul），余加纯水
3、一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的
4、DAB：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的部分，防止误差
5、用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完。