免疫组化(DAB试剂盒标准)

免疫组织化学技术

一，流程图：

二，详细操作：

（一）制作石蜡切片（详见后面的材料）

（二）脱蜡，透明，水化

1）脱蜡前先60度烘片30-40min;

2）二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3缸），各15min。注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本

3）梯度乙醇入水：将切片依次置入100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各5min;

（三）抗原修复

操作：1）6min45s烧开修复液

(柠檬酸0.2g+柠檬酸三钠 1.5g蒸馏水稀释至500mL,PH为6.0)

2）将组织放入修复液置于微波炉中焖5分钟

3）将修复液1min20s再烧开

4）组织再焖5分钟

5）取出烧杯，使液体和组织自然冷却

6）PBS冲洗3分钟1次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜)，PBS 冲洗3分钟1次

（四）孵育

操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢10min，PBS冲洗3分钟x3次；

2）封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片35ul山羊血清，室温下孵育30分钟（注意：此步操作后不用PBS冲洗）；

3）加一抗(PCNA兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作液（1:200比较好）2h，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；

加完一抗后，最好4度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可放在湿盒，第二天在37度或者室温复温30—40min，复温也要放在湿盒内

4）加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG复合物）：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；

5）加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟⨯ 3次；

（五）显色

1）DAB染色：每个脑片35ul新鲜配制的DAB显色液，室温孵育10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。

2）苏木素复染：苏木素染色30s（可以用塑料架子浸泡或者枪头滴）→自来水冲洗→PBS溶液返蓝10-20min（还可以浸泡10min的纯水）

3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明2-3分钟→中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干，观

察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面）

备注：

1、PBS配制：团队常用一包PBS粉末，配制2000ml纯水，加6ml 的NAOH，PH在7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的NAOH 或者酸量不同，但是PH一般是一样的）

2、一抗工作液，一般配制成5ml，0.3%的牛血清（0.15g），5%的羊血清（250ul），余加纯水

3、一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的

4、DAB：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的部分，防止误差

5、用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完