实验七 苯硫脲尝味的群体遗传学调查

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实验七苯硫脲尝味的群体遗传学调查

一、实验目的

1. 测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型,理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。

2.了解酶切扩增多态序列(又称为PCR-RFLP)技术的原理,学会用PCR-RFLP 技术检测单核苷酸多态性(SNPs)。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。

二、实验原理

苯硫脲(phenylthiocarbamide,PTC)是硫脲的苯基衍生物,为白色结晶粉末,因含有硫代酰胺基(N-C=S)官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000-1/50,000 PTC浓度溶液味道的人(苦涩味,少数人感到甜味)称为苯硫脲“尝味者”, 只能尝出PTC 浓度大于1/24,000 溶液的味道的人称为苯硫脲“味盲者(nontaster)”。

PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状,是由位于7 号染色体上的一种苦味味觉感受器基因 TAS2R38 决定的,属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1/750,000-1/6,000,000 的PTC 溶液的苦味,杂合子(Tt) 只能尝出1 /480,000-l/380,000 的PTC溶液的苦味。

人类的 PTC 尝味基因又名 PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs):一处是145 位,味盲者为 G145(编码丙氨酸ala),尝味者为C145(编码脯氨酸pro);第二处是785 位,味盲者为T785(编码缬氨酸val),尝味者为C785(编码丙氨酸ala);第三处在886 位,味盲者为A886(编码异亮氨酸ile),尝味者为G886(编码缬氨酸val)。因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262,被称为AVI等位基因,而尝味者的三处是pro49、 ala262 和val262,被称为PAV等位基因。如图1所示。

图1 PTC 尝味基因上的三个SNP位点

味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切酶 Fnu4H1 的识别位点(识别序列

5’-GC↓NGC3’),如果是尝味者,则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位点(GCTGC)。因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态性,设计引物扩增包含785 位SNP位点的PTC Fnu4H1 基因编码区的一部分,然后用Fnu4H1切割扩增产物,根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型(haplotype)。如图2所示。

图 2 味盲者PTC 尝味基因编码区序列

三、实验用品

1.人口腔上皮细胞总DNA、引物Ⅰ和Ⅱ(20μΜ)、TaqDNA聚合酶(5U/μl)、10×PCR 反应缓冲液、dNTP(2.5mM)、灭菌蒸馏水、限制性内切酶Fnu4H1(20U/μl)、10×酶切缓冲液。

2.2%的琼脂糖凝胶、1×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、Goldview染料。

3.PCR仪、凝胶成像系统、微量加样器(5μl、20μl、200μl)、枪头(20μl、200μl)及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。

四、实验步骤

1. 口腔上皮细胞总DNA的提取

(1)每实验小组选取1 名受试者,用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。

(2)在1.5 ml 灭菌微量离心管中加入100 µL 灭菌水。

(3)受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧,刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。

(4)涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s。

(5)离心机瞬时离心10 s。

(6)沸水浴中煮沸5 min。

(7)离心机13200rpm 离心2 min。

(8)基因组DNA 4°C 保存备用。

2. PCR 扩增PTC基因片段,反应体系如下:

上游引物:hPTC Forward 5’-aactggcagaataaagatctcaatttat-3’ 下游引物:hPTC Reverse 5’-aacacaaaccatcacccctatttt-3’。按以上次序,将各物质加入到一只无菌的0.2ml离心管中。轻轻混匀后,离心5秒钟,加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面,然后放入PCR仪中进行循环反应。PCR反应程序如下:

94℃ 5min(预变性)---94℃ 30s(变性)---55℃ 30s(退火)---72℃ 30s(延伸)--- step 1 step 2 step 3 step 4

72℃ 10min(延伸)---4℃保存

step 5 step 6

其中从step2到step4循环40次,PCR产物总长303bp,反应结束后置4℃冰箱保存。

3. PCR产物的Fnu4H1酶切

反应体系15μl其成分如下:

PCR产物 6μl

Fnu4H1(10U/μl) 1μl

10X酶切缓冲液 2μl

无菌水 6μl

置37℃水浴消化1小时,4℃保存

4.琼脂糖凝胶电泳检测

(1)胶板的准备

取有机玻璃内槽,洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(注意,将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上,不要留空隙)。将有机玻璃内槽置于一水平位置,在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。

(2)2%的琼脂糖凝胶的制备

称取1克琼脂糖,置于锥形瓶内,加入50ml 1×TAE,瓶口用保鲜膜封盖,在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解,得到2%琼脂糖凝胶液,待其冷却至65℃左右,加入2.5μl 溴化乙啶贮存液(10mg/ml),使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中,控制灌胶速度,使胶液缓慢展开,避免产生气泡,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右,待胶凝固完全后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的样品槽。

(3)将凝胶放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液,预电泳10min。

(4)每份限制酶切产物取10μl,加2μl6×上样缓冲液,混匀后加入到样品孔中,以100V电泳50分钟。

(5)断电后取出凝胶,放在紫外透射仪中观察并记录PCR-RFLP结果。

电泳结果中基因型为TT的尝味者能够出现2条酶切条带,基因型为Tt的尝味者能够出现

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