细胞培养的基本方法
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时间，而不是指细胞群体倍增时间。可利用培养细 胞来研究细胞动力学、DNA合成代谢和有丝分裂。 细胞周期的时间测定有两种方法。
（1）同位素标记测定法 （2）流式细胞仪测定法 6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）比色法测定 细胞活力。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
12
一、活体染色
体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活的组织或细 胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。
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4
相差显微镜
相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的， 用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的 生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的 不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅 相位发生变化（x相位差），这种相位差人眼无法 观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用 光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活 细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的 区别是：用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的 物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液；
4）每毫升细胞பைடு நூலகம்液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀；
5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数；
6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色）
数目。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
14
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
18
2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 EB和PI均为荧光染料，可与DNA特异性结合。
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细胞培养的污染与检测
19
在细胞培养中，凡是与培养无关的杂质的混入培养系统称为污染。 对于组织细胞培养工作来说，污染是时常存在的，因此要努力避免 污染的发生。污染一般包括微生物、化学物、细胞等，其中微生物
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培养细胞的观察
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二、细胞计数法
1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数 目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只 有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。
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培养细胞的观察
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15
（2）吖啶橙荧光染色法 吖啶橙用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细
胞。与DNA结合呈亮绿色，与RNA结合呈橘红色至火红色。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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吖啶橙/溴化精选文乙本 锭双荧光染色
细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
17
二、染料排除检测法
由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却 不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞由于能排出进入细胞的 染料，故不易着色。 1、台盼蓝排除检测法
污染较多。以下着重介绍微生物的污染、预防与检测。
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细胞培养的污染与检测-污染途径
20
一、污染途径
1、空气 空气是微生物及粉尘颗粒传播的最主要途径。 2、器材 各种培养皿及器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染。 3、操作 无菌操作观念不强、实验操作马虎、动作不准确、使用污染的器具或密封不 严等，都可能造成污染。同时培养两种以上细胞，操作不规范，交叉使用吸 管或者营养液瓶等会导致细胞交叉感染。
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2、活体染色方法
（1）台盼蓝染色
1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组 织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细 胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液；
2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞；
细胞培养的基本方法
1
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2
目录
A 培养细胞的观察 细胞培养中常用的染色方法 B
C 细胞培养的污染和检测
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3 培养细胞的观察
无论是研究体外细胞的增殖生长状态还是生物学性状， 都需要对其进行观察和检测，其内容涉及形态生物学、 细胞生物学、遗传学、生理生化、分子生物学等多学科 的技术手段。这里主要介绍观察检测体外培养物最常用 的技术方法。
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培养细胞的观察
一、相差显微镜观察：
能增强结构之间的反差
1、主要装置 （1）环装光栅
不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑
（2）相板
相差板上上装有吸收膜及推迟相位的相位 膜
5 （3）中心望远镜
辅助望远镜
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培养细胞的观察
6
2、观察活细胞的方法 将相差装置与倒置光装置结
合起来而制造的倒置相差显微镜广泛 用于观察生长在瓶皿底面的细胞。
3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分 率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞中的 细胞分裂相数。 4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细 胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和部分 底物材料的生物相容性。
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培养细胞的观察
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5、细胞周期 这里的细胞周期仅指一个细胞的分裂生长周期
1、活体染料的类别
可分为碱性和酸性活体染料两大类。
碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦 油蓝、亮焦油 紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利 亚蓝）。
酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。
体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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培养细胞的观察
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3、相差物镜的选择与使用 正（暗,即标本比周围环境暗）反差适用于物体细微结构和形态、计
数、运动的观察。PL（低亮，视场平坦型物镜）相差物镜常用于折射率比较 弱的物体，PLL（低低亮，长工作距离平场物镜）则适用于折射强的物体。
负（明，即标本比周围环境亮）反差适用于物体形态、计数和物体运 动的观察，物体折射率比较弱是采用NM（中负）相差物镜，折射率比较强时 采用NH（高负）相差物镜。
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培养细胞的观察
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4、相差显微镜使用注意事项 1）当换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调
中，否则成像效果不佳； 2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，
以免影响观测效果； 3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像
效果才明显；4）光路最好加单色（如黄绿色）滤光片以提高相差显微镜 的分辨率。
（1）同位素标记测定法 （2）流式细胞仪测定法 6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）比色法测定 细胞活力。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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一、活体染色
体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活的组织或细 胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。
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相差显微镜
相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的， 用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的 生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的 不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅 相位发生变化（x相位差），这种相位差人眼无法 观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用 光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活 细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的 区别是：用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的 物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液；
4）每毫升细胞பைடு நூலகம்液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀；
5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数；
6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色）
数目。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
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2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 EB和PI均为荧光染料，可与DNA特异性结合。
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细胞培养的污染与检测
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在细胞培养中，凡是与培养无关的杂质的混入培养系统称为污染。 对于组织细胞培养工作来说，污染是时常存在的，因此要努力避免 污染的发生。污染一般包括微生物、化学物、细胞等，其中微生物
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培养细胞的观察
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二、细胞计数法
1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数 目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只 有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。
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培养细胞的观察
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（2）吖啶橙荧光染色法 吖啶橙用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细
胞。与DNA结合呈亮绿色，与RNA结合呈橘红色至火红色。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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吖啶橙/溴化精选文乙本 锭双荧光染色
细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
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二、染料排除检测法
由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却 不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞由于能排出进入细胞的 染料，故不易着色。 1、台盼蓝排除检测法
污染较多。以下着重介绍微生物的污染、预防与检测。
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细胞培养的污染与检测-污染途径
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一、污染途径
1、空气 空气是微生物及粉尘颗粒传播的最主要途径。 2、器材 各种培养皿及器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染。 3、操作 无菌操作观念不强、实验操作马虎、动作不准确、使用污染的器具或密封不 严等，都可能造成污染。同时培养两种以上细胞，操作不规范，交叉使用吸 管或者营养液瓶等会导致细胞交叉感染。
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2、活体染色方法
（1）台盼蓝染色
1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组 织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细 胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液；
2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞；
细胞培养的基本方法
1
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A 培养细胞的观察 细胞培养中常用的染色方法 B
C 细胞培养的污染和检测
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3 培养细胞的观察
无论是研究体外细胞的增殖生长状态还是生物学性状， 都需要对其进行观察和检测，其内容涉及形态生物学、 细胞生物学、遗传学、生理生化、分子生物学等多学科 的技术手段。这里主要介绍观察检测体外培养物最常用 的技术方法。
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培养细胞的观察
一、相差显微镜观察：
能增强结构之间的反差
1、主要装置 （1）环装光栅
不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑
（2）相板
相差板上上装有吸收膜及推迟相位的相位 膜
5 （3）中心望远镜
辅助望远镜
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培养细胞的观察
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2、观察活细胞的方法 将相差装置与倒置光装置结
合起来而制造的倒置相差显微镜广泛 用于观察生长在瓶皿底面的细胞。
3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分 率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞中的 细胞分裂相数。 4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细 胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和部分 底物材料的生物相容性。
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培养细胞的观察
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5、细胞周期 这里的细胞周期仅指一个细胞的分裂生长周期
1、活体染料的类别
可分为碱性和酸性活体染料两大类。
碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦 油蓝、亮焦油 紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利 亚蓝）。
酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。
体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。
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细胞培养中常用的染色方法-活体染色
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培养细胞的观察
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3、相差物镜的选择与使用 正（暗,即标本比周围环境暗）反差适用于物体细微结构和形态、计
数、运动的观察。PL（低亮，视场平坦型物镜）相差物镜常用于折射率比较 弱的物体，PLL（低低亮，长工作距离平场物镜）则适用于折射强的物体。
负（明，即标本比周围环境亮）反差适用于物体形态、计数和物体运 动的观察，物体折射率比较弱是采用NM（中负）相差物镜，折射率比较强时 采用NH（高负）相差物镜。
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培养细胞的观察
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4、相差显微镜使用注意事项 1）当换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调
中，否则成像效果不佳； 2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，
以免影响观测效果； 3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像
效果才明显；4）光路最好加单色（如黄绿色）滤光片以提高相差显微镜 的分辨率。