基因工程实验方案

实验一、大肠杆菌质粒的提取与电泳检测

一、实验目的

学习质粒DNA提取的基本原理，理解各种试剂的作用，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程提供载体原料。

二、实验原理

将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具较载体。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。

质粒是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞总，大小从1—200kb不等。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能复制，而宿主即使没有质粒也可以正常存活。但质粒的存在使得宿主细胞具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。常用的质粒载体大小在2.7—10kb之间。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。

细菌质粒的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量小，易于复性的特点进行的。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短时间内复性而染色体DNA不能复性。用碱变性方法提取质粒就是利用离子型表明活性剂SDS溶解细胞膜上的脂肪及蛋白，在pH 高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，成了杂乱无章的片段。而相对分子质量较小的质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当pH4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能恢复而形成缠连的网状结构，变性DNA与菌体的蛋白质凝聚成块。经过离心，出去的沉淀是变性的染色体DNA和蛋白质杂质，而上清液中的质粒DNA分子，则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的时候，不光DNA还有性质相似的RNA也一起被沉淀下来。为了除去RNA，可以利用RNA酶进行处理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往会采用一些复合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不仅使RNA酶失活，还能有效去除菌

体的蛋白质等物质。因为只用无水乙醇沉淀，样品中还是混有蛋白质。所以为了获得高纯度质粒，应在无水乙醇沉淀前，先用苯酚进行处理，以便除去其中的蛋白质。

三、实验试剂

1.含质粒的大肠杆菌菌株

LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、调pH7.2

抗生素：氨苄青霉素：母液100mg/mL，工作浓度100ug/mL

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）

溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。

TE缓冲液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA

2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl

3mol/LNaAc(pH5.2

苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）、冰冷无水乙醇、冰冷70%乙醇

碱裂解法小量提取质粒DNA步骤如下：

（a）挑单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。

（b）每管取1ml菌液然后12,000 g离心30 秒，集菌。

（c）加200 μl溶液I，用振荡器剧烈振荡悬浮菌体。

（d）加300 μl新配制的溶液II，温和颠倒混匀5次以上。

（e）溶液澄清后立即加入300 μl预冷的溶液III，混匀后冰上放置5分钟。（f）4℃、12000 g离心10 （或5）分钟。

（g）取上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后，4℃、12000 g离心10 分钟沉淀蛋白。

（h）吸取上清，加等体积异丙醇，混匀。室温放置10分钟。

（i）12000 g离心10 分钟，弃上清，再用75% (v/v)乙醇洗涤沉淀，12000 g 离心5分钟。

(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于适量水或TE（50ul），（-20°C）保存备用。质粒DNA的检测:取5ul的质粒与2ul的6×上样缓冲液混合后，在0.7%凝胶上电泳检测。

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。

溶液I的作用：

１、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此可用适当浓度和适当pH值的Tris-HCl溶液。

２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I 中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合