慢病毒
《慢病毒简介》课件
利用慢病毒感染宿主细胞的特点，将抗病毒基因 导入细胞中，增强细胞对病毒的抵抗力，预防和 治疗病毒感染性疾病。
慢病毒与其他基因转移技术的比较
慢病毒与质粒DNA的比较
质粒DNA的基因转移效率相对较低，而慢病毒可以将外源基因高 效整合到宿主细胞基因组中，实现长期表达。
慢病毒与纳米材料的比较
通过构建基因敲除或敲入细胞系，可 以研究特定基因对细胞生长、分化和 凋亡等过程的影响。
基因治疗研究
慢病毒载体可以用于将正常基因导入到缺陷基因中，以纠正或补偿缺陷基因的功 能，为基因治疗提供了新的手段。
在基因治疗研究中，慢病毒载体被广泛应用于将治疗基因导入到患者体内，以治 疗遗传性疾病和恶性肿瘤等疾病。
慢病毒的基因组结构简单，易于操作和控制，降低了潜在的基因突变风 险。
慢病毒的包装和生产过程经过严格的质量控制，确保产品的安全性和稳 定性。
慢病毒的免疫原性
在某些情况下，慢病毒载体可能触发机体免疫系统对 载体抗原的免疫应答，但这种免疫反应通常较弱且可 控。
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慢病毒包装细胞选择
慢病毒包装需要选择特定的细胞 系作为包装细胞，常用的包装细 胞有293T、Hela和HepG2等。
这些细胞系能够表达慢病毒所需 的gag、pol和env基因，从而产 生具有感染能力的慢病毒颗粒。
在选择包装细胞时，需要考虑细 胞的生长特性和对转基因的兼容 性，以确保慢病毒的包装效率和
探索慢病毒与其他基因转移技术（如质粒、纳米材料等）的联
合应用，实治疗领域的应用前景
慢病毒原理
慢病毒原理慢病毒，又称慢性病毒，是一类感染机体后具有长期潜伏期的病毒。
与急性病毒不同，慢病毒具有较长的潜伏期和慢性发展过程，因此对人类和动物健康造成了长期的威胁。
慢病毒的原理主要包括传播途径、感染过程和致病机制。
首先，慢病毒的传播途径多样，主要包括血液传播、性传播、母婴传播和空气传播等。
其中，血液传播是慢病毒最为常见的传播途径之一，例如艾滋病病毒（HIV）通过血液传播是造成艾滋病的主要原因之一。
另外，慢病毒还可以通过性接触、母婴垂直传播和呼吸道飞沫传播等途径传播，因此在预防和控制慢病毒感染方面需要采取多种有效的措施。
其次，慢病毒的感染过程相对复杂。
一般来说，慢病毒感染后会经历潜伏期，这段时间内病毒在宿主体内进行潜伏和复制，但并不引起明显的临床症状。
随着时间的推移，病毒逐渐破坏宿主的免疫系统和器官组织，最终导致慢性疾病的发生。
以乙型肝炎病毒为例，感染者在潜伏期内往往没有明显症状，但长期感染会导致肝脏损伤，甚至引发肝硬化和肝癌等严重后果。
最后，慢病毒的致病机制涉及多个方面，包括病毒的侵入、复制和传播，以及宿主免疫系统的应答和病理损伤等。
病毒侵入宿主细胞后，利用细胞内的生物合成机制进行复制，不断增加病毒颗粒的数量。
同时，病毒的复制和蛋白质的表达会诱导宿主免疫系统的应答，但慢病毒往往能够逃避宿主的免疫攻击，导致病毒长期存在于宿主体内。
此外，慢病毒的复制和病理变化还会引起宿主组织的炎症反应和器官功能损伤，最终导致慢性疾病的发生和发展。
综上所述，慢病毒的原理涉及传播途径、感染过程和致病机制等多个方面，对于预防和控制慢病毒感染具有重要意义。
因此，加强对慢病毒的研究和监测，制定科学有效的防控策略，对于维护人类和动物健康具有重要意义。
慢病毒在病毒学研究中的应用
慢病毒在病毒学研究中的应用随着科技的不断发展和进步，病毒学研究也在不断地深入和扩展。
慢病毒的发现和应用，为病毒学研究提供了新的思路和方法。
本文将探讨慢病毒在病毒学研究中的应用。
一、慢病毒是什么慢病毒是一种病毒，属于逆转录病毒的一类。
其基因组为RNA，但可以通过逆转录酶转录成为DNA。
慢病毒具有很强的侵染性，可以感染多种细胞，包括神经细胞和免疫细胞等。
慢病毒具有长周期的生命周期，可以在细胞中长期存在，慢慢地对细胞进行破坏。
慢病毒感染可以导致一些慢性疾病的发生和发展，如艾滋病等。
二、慢病毒在病毒学研究中的应用1. 基因治疗慢病毒可以用于基因治疗。
慢病毒感染后可以将基因序列导入细胞，并在细胞内进行表达和复制。
这为基因治疗提供了理论基础和实验依据。
因为慢病毒可以继续存在于细胞内，从而使导入的基因序列长期保持在细胞内，具有稳定和持久的表达效果。
而且慢病毒也可以甄别目标细胞，靶向进行基因传递。
这可以大大提高基因治疗的效果和成功率。
2. 疫苗开发慢病毒可以用于疫苗的开发。
疫苗的免疫机制是在免疫细胞中产生对病原体的免疫反应，并产生免疫记忆。
慢病毒可以被作为病毒载体，将目标病原体的基因序列导入免疫细胞中，使其产生对病原体的反应。
这样，就可以通过慢病毒制备出特异性疫苗，来预防和治疗一些病原体感染导致的疾病，如乙型肝炎等。
3. 疾病模型研究慢病毒可以用于疾病模型的建立和研究。
慢病毒的侵入和感染能力很强，可以模拟一些疾病在细胞和组织层面的发展和变化。
例如，慢病毒可以在神经细胞中表达外源基因，模拟一些神经退行性疾病的发生和发展过程。
这有助于揭示疾病的发生机制和治疗方法。
三、慢病毒在病毒学研究中的挑战和应对1. 安全性问题慢病毒具有侵染性和导入基因序列的能力，因此需要对其进行严格的安全性检测和监测。
在疫苗和基因治疗等方面的应用中，需要确保慢病毒对人体无害，不会导致不良反应和病原体的突变产生。
2. 菌株选择问题在慢病毒的应用过程中，需要选择最适合应用的菌株，以确保其对细胞和组织的侵染和基因导入效果最佳。
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒包装的原理
慢病毒包装的原理
慢病毒（lentivirus）是一类RNA病毒，通常被用于基因转染和基因治疗。
慢
病毒包装是指将需要传递的外源基因包装到慢病毒颗粒中，以便将其传递到目标细胞中。
慢病毒包装的原理涉及到病毒颗粒的组装、包装信使RNA（mRNA）和包
装蛋白等多个步骤。
首先，慢病毒包装的原理涉及到病毒颗粒的组装。
慢病毒的组装是一个复杂的
过程，它涉及到病毒基因组的复制、转录和翻译等多个步骤。
在这个过程中，病毒基因组的RNA被转录成mRNA，然后被翻译成包装蛋白和其他病毒结构蛋白。
这
些蛋白质随后会组装成完整的病毒颗粒。
其次，慢病毒包装的原理还涉及到包装mRNA的过程。
在病毒颗粒组装的过
程中，包装蛋白会识别并结合到病毒基因组的特定序列上，然后将mRNA包装到
病毒颗粒中。
这个过程是高度特异性的，只有符合特定序列的mRNA才能被包装
到病毒颗粒中。
最后，慢病毒包装的原理还涉及到包装蛋白的作用。
包装蛋白在病毒颗粒组装
的过程中起着关键的作用，它能够识别特定的RNA序列，并将其包装到病毒颗粒中。
此外，包装蛋白还能够保护包装的mRNA免受降解的影响，从而确保外源基
因的稳定传递。
综上所述，慢病毒包装的原理涉及到病毒颗粒的组装、包装mRNA和包装蛋
白等多个步骤。
这些步骤是高度协调和特异性的，能够确保外源基因的稳定传递到目标细胞中。
因此，对慢病毒包装原理的深入研究不仅有助于我们更好地理解病毒传播和基因转染的机制，还有助于开发更高效、更安全的基因治疗和基因转染技术。
慢病毒的生物学特性及其致病机制
慢病毒的生物学特性及其致病机制慢病毒是一类具有强烈致病性的病毒，它们以极慢的速度破坏宿主正常生理功能、繁殖和分化能力，导致疾病的发展和进展。
与普通病毒比较不同的是，慢病毒在宿主体内可以持续存在很长时间，这增加了患者治疗和康复的难度。
1. 慢病毒的分类和基本结构特征慢病毒广泛存在于自然界中的哺乳动物、鸟类等多种生物中。
它们属于反转录病毒，具有某些细菌和动物毒素中没有的结构和特征。
慢病毒的病原体和感染机理十分复杂，不同种类的慢病毒具有不同的结构和基因组组成。
慢病毒的基本结构特征是具有外包膜和筛状结构的核糖体。
它们的外包膜包裹着一个内接膜，在其表面上伸出胞外糖蛋白，使得它们能够识别和与宿主细胞表面的特定受体相互作用。
同时，慢病毒的筛状结构既可以作为病毒基因组RNA的质朴，也可依赖于宿主细胞核酸酶所合成的DNA同步繁殖。
2. 慢病毒在宿主体内的繁殖和扩散慢病毒的开发依赖于它们能够在宿主体内生存并繁殖。
它们通过感染宿主细胞，利用细胞自身的生物合成机制，表示复杂的病毒蛋白和合成病毒基因组。
慢病毒得以在宿主细胞质中主导细胞代谢活动。
慢病毒在宿主体内的繁殖过程是长期缓慢的。
一些类型的慢病毒的复制可以生产DNA和RNA亚基，并且它们需要通过激活受体和核糖体的复杂机制，才能使病毒基因组复制或转录。
这使得慢病毒可以长期依赖于宿主细胞，使宿主体内病毒基因组的拷贝数目不断增加。
3. 慢病毒的致病机制慢病毒的致病机理十分复杂，它们具有多个不同的致病因素，并经常与宿主免疫反应的效应器相互作用。
慢病毒的感染机理包括直接细胞毒性和免疫调节。
慢病毒的直接毒性是指病毒和细胞直接交互可能造成毒性作用。
这是因为慢病毒感染宿主后，其基因组可以和宿主基因组相互作用导致细胞质发生持续性的炎症反应，此时会释放出任何病毒产物。
慢病毒的免疫调节机制是指病毒通过干预宿主免疫反应而导致的病理反应。
慢病毒感染后，会通过感染细胞的多个组织，使得免疫细胞进入炎症灶。
慢病毒的基本原理和应用
慢病毒的基本原理和应用慢病毒（Slow Virus）是指一种具有长期潜伏期或长期进展的病毒，在宿主体内繁殖较慢，而病程较长的感染性疾病。
慢病毒以肝炎病毒、感能病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）等为代表。
慢病毒是一种特殊的病毒，其感染机制、致病机理和治疗方法都与其他病毒不同。
一、慢病毒的基本原理慢病毒的基本原理可以简单地分为以下几个方面。
1. 慢病毒的潜伏期长。
以艾滋病毒为例，患者感染后，可潜伏多年，甚至10年以上，其间没有任何症状表现。
这就给治疗患病的时机带来了难度，也使得艾滋病具有了很强的传染性。
2. 慢病毒可以长期影响人体的免疫系统。
慢病毒比其他病毒更加复杂，可以在人体内长期生存。
慢病毒通过影响人体的免疫系统，消耗人体的免疫力，使得患者陷入易感染、易发病、病程较长的状态。
3. 慢病毒的感染难以被查明。
由于慢病毒繁殖较慢，对人体产生的毒性较小，因此在感染初期难以快速检测出来。
这也是慢病毒传染性强的原因之一。
二、慢病毒的应用虽然慢病毒对人体的危害不小，但科学家也发现慢病毒也具有较大的疗效。
下面我们来看看慢病毒的应用领域。
1. 肿瘤治疗。
慢病毒呈现的长期作用和稳定的表达是其治疗肿瘤的重要特点之一。
利用载了有效目标基因的慢病毒病毒载体，经过基因修饰而改变其发病机制，可以将慢病毒载体作为介导治疗的载体，将其放置在肿瘤细胞中，从而减少肿瘤细胞的生长。
2. 神经退行性疾病的治疗。
神经退行性疾病是指一类慢性神经系统疾病，常常由于神经元死亡导致，如阿尔茨海默症、帕金森病等。
慢病毒通过基因修饰可帮助人体产生某种神经元离子通道，通过将离子通道放在感觉神经元和中枢神经元上，减少神经元死亡，保护人体神经系统的健康。
3. 病毒基因敲除治疗。
利用了慢病毒的基因敲除能力，将慢病毒转化成人体行为控制器，将慢病毒病毒载体作为载体，递送到患者体内，进行病毒治疗。
通过这种治疗方式，可以更加有效地处理患病问题，避免上述疾病的出现，并显著提高生命质量。
慢病毒
梅迪／维斯纳病毒是最早归入慢病毒亚科的动物病毒
慢病毒属
ห้องสมุดไป่ตู้灵长类慢病毒
人类免疫缺陷病毒1 型、2型（ HIV-1、 HIV-2 )
猿猴免疫缺陷病毒(SIV) 马传染性贫血病毒(EIAV)
慢病毒病
主要是由于慢病毒感染引起的一些疾病。
慢病毒感染引起人和动物肺、关节、神经、造血及免疫 系统的疾病。病毒侵入机体后， 潜伏期往往较长，通过某些 血液细胞散播刊其它组织，机体虽然存在着细胞及体渡免疫
应答，但难以把病毒杀灭。
1967年,我国新疆的于田羊场首次报道绵羊慢病毒病 ( 张福等,1998 ) ， 后来相继发现猫和牛的慢病毒病。
1.病毒在体内的潜伏、散播及激活
动物慢病毒主要潜伏在巨噬细胞中由这类细胞通过血液或 脑脊液 ( CSF)将其散播到其它组织处，HIV感CD4+淋巴细胞， 当受感染的细胞处于G。期时病毒的复制受到限制，该期细 胞对于病毒来讲属 于非允许性细胞，病毒感染这些静止期细 胞便形成了其潜伏态(或称晦暗期) 。随着细胞被活化，受限 制的病毒就能复制和表达。
Gudnadottir(1974)提出的“抗原漂移”(Antigenic drift)解释 了维古那病毒为何能在宿主体中长期寄生。 Narayan等[2-5] 试验证明和发展了此设想。他们从维古那病毒持续感染绵羊 体中分离出抗原性不同的变异株，发现这些变异由env基因 点突变引起的。
HIV和动物慢病毒一样，抗原也存在着变异。其中包膜糖蛋 白gP120高度可变，序列中古有高可变区( H )和恒定区(c)， Hy区变异并非只由氨基酸取代引起，小片段重复、欢失也有 发生。gP120序列中和病毒存活有关的区域(CD结合区，融 台区t转膜锚状结构域) 高度保守，诱导机体产生中和抗体的 氨基酸区易发生改变，固此，慢病毒利此种机制逃脱了机体
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
慢病毒纯化
慢病毒纯化引言慢病毒（Slow virus）是一类具有潜伏期长、传播缓慢的病毒。
它们主要侵害中枢神经系统，引起一系列慢性疾病，如亚急性硬化性全脑炎、破伤风等。
由于慢病毒的潜伏期长、传播缓慢，对患者的治疗和预防带来了极大的困难。
因此，对慢病毒的纯化研究至关重要。
纯化方法慢病毒纯化是将慢病毒分离和提纯出来的过程。
常用的慢病毒纯化方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、密度梯度离心法等。
以下将介绍使用密度梯度离心法进行慢病毒纯化的步骤和技术要点。
材料准备•脑组织样本（含有慢病毒）•PBS缓冲液•10% Triton X-100•加碘氯仿•硫酸铂•Sucrose•KBr步骤1.准备慢病毒感染的脑组织样本，并用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
2.将脑组织样本加入适量的PBS缓冲液中。
3.加入10% Triton X-100，破解细胞膜并释放病毒。
4.使用高速离心将细胞碎片和杂质从悬浮液中分离出来。
5.收集上清液，加入加碘氯仿，离心使其分离。
6.将上清液转移到新离心管中，然后加入一定浓度的硫酸铂。
7.使用离心机进行高速离心，使病毒与硫酸铂结合。
8.分离上清液，加入Sucrose溶液中。
9.准备密度梯度离心管，将上清液缓慢地加入离心管中。
10.使用超速离心机进行离心，使病毒在密度梯度中分离。
11.分离纯化后的病毒。
技术要点密度梯度离心法密度梯度离心法是一种根据物质密度差异来分离混合物的方法。
在慢病毒纯化中，通过在离心管中制备密度递增的梯度，利用不同物质在梯度中的沉降速度差异来实现病毒的分离和纯化。
脑组织样本处理脑组织样本是进行慢病毒纯化的关键原料。
在收集脑组织样本后，应及时用PBS缓冲液进行冲洗，去除杂质。
通过加入10% Triton X-100等破解细胞膜的方法，可以有效释放慢病毒。
超速离心机超速离心机是进行密度梯度离心的必备设备，具有高速、高精度离心的特点。
合理设置超速离心机的离心参数，如转速、离心时间等，有助于提高慢病毒纯化的效果。
慢病毒原理
慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞. Lentiviral vectors can mediate the efficient delivery, integration and stable expression of transgenes in dividing as well as nondividing cells, either in vitro or in several organs in vivo. As such, they open exciting possibilities for both basic research and the genetic treatment of human diseases.Lentivector particles are generated by co-expressing the virion packaging elements and the vector genome in a cell used as producer, for instance a 293 or 293T human embryonic kidney cell. Inthe case of HIV-1-based vectors, the core and enzymatic components of the virion come fromHIV-1, while the envelope is derived from a heterologous virus, most often vesicular stomatitis virus (VSV) due to the high stability and broad tropism of its G protein. By convention, we designate the former elements as the LV packaging system the latter as the envelope.In order to produce lentivectors you need 3 components:∙vector, e.g. pWPTS, pWPXL, pWPI, pLVTHM∙packaging system, e.g. pCMV-dR8.91, pCMV-dR8.74psPAX2 (2nd generation)∙envelope plasmid, e.g. pMD2GThree generations of HIV-based LV packaging systems have been successively developed for production of lentivectors by transient transfection.∙The first generation LV packaging system encompasses all HIV-1 genes besides the envelope.∙The second generation LV packaging system is additionally deleted in all viral auxilliary genes, i.e. vpr, vif, vpu and nef. Examples: pCMV-dR8.91, pCMV-dR8.74, psPAX2The third generation LV packaging system comprises only gag, coding for the virion main structural proteins, pol, responsible for the retrovirus-specific enzymes, and rev,which encodes a post-transcriptional regulator necessary for efficient gag and polexpression. a cDNA encoding rev is provided on a separate plasmid. The third generation packaging system offers maximal biosafety but is more cumbersome, involving thetransfection of four different plasmids in the producer cells. Example of the 3rdgeneration packaging combo: pMDL g/p RRE + pRSV-Rev.All our lentivectors contain wt 5'LTR and can be packaged only using 2nd generation packaging system (as wt 5'LTR requires TAT for activation). If you wish to use 3rd generation packaging system you need to have a lentivector with a chimeric 5'LTR e.g. CCL-, RRL-, etc, in which HIV promoter was replaced with CMV or RSV, thus making them TAT-independent. The lentivectors carrying the chimeric 5'LTR can be packaged into both, 2nd or 3rd generation packaging system.The production of vector particles by transient transfection of 293T cells with the second generation packaging system will satisfy most applications.The vector itself is the only genetic material transferred to the target cells. It typically comprises the transgene cassette flanked by cis-acting elements necessary for its encapsidation, reverse transcription and integration. As previously done with oncoretroviral vectors, advantage was taken of the gymnastics of reverse transcription to engineer self-inactivating (SIN) HIV-1-derived vectors, which lose the transcriptional capacity of the viral long terminal repeat (LTR) once transferred to target cells. This minimizes the risk of emergence of replication competent recombinants (RCR) and avoids problems linked to promoter interference.。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒简介专题知识讲座
transduction efficiency in the brain.
为了增加基因在脑中传递, 新一代慢病毒 载体包含cPPT, 一个来自gag区约180 bp区 域, 从而增加了原病毒DNA进入核, 也提升 了在大脑中转导效率。
载体质粒携带了5’端LTR, 和全部5’端非翻译区域, 另外还带 有rev应答元件（RRE）。
包膜表示质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用 来代替了原病毒env基因。
慢病毒简介专题知识讲座
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3.2第二代HIV-1起源慢病毒载体
1997年,Zufferey等将包装质粒上vif、vpr、
基础 pol基因编码病毒复制所需酶, 如反转录酶、整合酶、蛋白
结构 酶。
env基因编码病毒包膜糖蛋白, 决定病毒感染宿主靶向性。
rev编码蛋白调整gag、pol、env表示水平。
调整 tat编码蛋白参加RNA转录控制。 基因 4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef编码蛋白则作为毒力因子
参加宿主细胞识别和感染。两端为长末端重复序列 (LTR), 内含复制所需顺式作用元件。
2. encoding the packaging proteins (minimally including gag and pol, often including tat and rev on the same plasmid, and in some cases the accessory genes vif , vpr, vpu, and nef),
本身失活型（SIN）慢病毒载体3’端LTRU3区开 启子发生失活突变后, 在逆转录过程中转移至 5’LTR。这么载体整合入靶细胞, 将不会产生完整 长度载体RNA, 所以命名为“本身失活型载体”。
《慢病毒简介》课件
早期诊断和及时治疗
对于慢病毒疾病，早期诊断和治疗至关重要，同时要坚持长期规范治疗。
效果展示
慢病毒的结构
慢病毒感染
慢病毒的结构和其它病毒不同， 非常独特。
慢病毒在人体内的繁殖过程十 分复杂，可以通过细胞表面的 蛋白质进入宿主细胞。
病毒疫苗
慢病毒的疫苗研制一直是医学 界努力的方向，但目前尚未形 成可行的疗法。
慢病毒的特点
远距离传播
慢病毒可以通过血液、乳汁、 精液、唾液等途径传播。
难以治愈
慢病毒疾病的治疗难度大， 时间长，费用高，并且很多 疾病目前只有控制不治。
多系统受侵
慢病毒感染后，病毒会向不 同的组织和器官迁移，导致 疾病涉及多个系统。
慢病毒的分类
病毒名称 人类免疫缺陷病毒 人类T细胞白血病病毒 家牛难病毒
主要疾病 艾滋病 成人T细胞白血病 嗜酸性胞细胞增多症
慢病毒的传播途径
注射毒品
通过使用共用针头、注射器等 器具，易传播病毒。
性行为传播
通过性器官传播病毒，性接触 时使用避孕套可以有效防护。
母婴传播
孕期感染、分娩和哺乳时均有 传播的可能。
慢病毒的主要疾病
1
艾Байду номын сангаас病
发病率高，反复发作，会导致严重的免疫缺陷，终致死亡。
慢病毒简介
慢病毒是一类致病性病毒，常常引起多种慢性疾病。本PPT将对慢病毒的定 义、特点、分类、传播途径、主要疾病、预防和控制进行详细介绍。
慢病毒的定义
1 长潜伏期
慢病毒具有长达数年乃 至十年以上的潜伏期。
2 慢性持续感染
慢病毒一旦侵入宿主体 内，便会持续不断地繁 殖，长期感染宿主。
3 变异性强
慢病毒包装的原理
慢病毒包装的原理慢病毒（lentivirus）是一类能够将基因信息稳定地整合到宿主细胞基因组中的病毒，因其具有较高的转染效率和广泛的宿主细胞范围而被广泛应用于基因治疗、基因编辑和细胞治疗等领域。
慢病毒的包装是指将外源基因载体包装入慢病毒颗粒中，使其具有传递和整合到宿主细胞基因组的能力。
本文将介绍慢病毒包装的原理及其相关技术。
慢病毒包装的原理主要包括载体构建、包装细胞系和包装技术三个方面。
首先是载体构建，即将外源基因插入到慢病毒基因组中，构建成慢病毒表达载体。
慢病毒基因组包括基因组RNA和辅助质粒DNA两种形式，通过重组技术将外源基因插入到慢病毒基因组中，并在适当的位点上加入启动子、终止子和调控元件，构建成慢病毒表达载体。
其次是包装细胞系的建立。
包装细胞系是指能够表达慢病毒包装蛋白的细胞系，通常采用293T细胞或HEK293细胞。
通过转染慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白，从而实现慢病毒颗粒的包装和产生。
最后是包装技术，主要包括质粒转染、病毒包装和病毒收集等步骤。
质粒转染是指将慢病毒表达载体和包装蛋白表达质粒转染至包装细胞系，使其在细胞内表达慢病毒包装蛋白。
病毒包装是指慢病毒包装蛋白识别慢病毒基因组RNA，并将其包装成慢病毒颗粒的过程。
病毒收集是指通过超速离心或滤膜浓缩等方法，从包装细胞系的培养上清中收集慢病毒颗粒。
总的来说，慢病毒包装的原理是通过构建慢病毒表达载体，利用包装细胞系表达慢病毒包装蛋白，将外源基因包装入慢病毒颗粒中，最终实现慢病毒的包装和产生。
这一技术为基因治疗和基因编辑研究提供了重要工具，也为细胞治疗等领域的发展提供了有力支持。
随着基因治疗和细胞治疗的不断发展，慢病毒包装技术的进一步优化和改进将为相关研究和临床应用带来更多的机遇和挑战。
慢病毒的感染机制及其防治策略
慢病毒的感染机制及其防治策略慢病毒是一类病毒，与传统的快速病毒不同，它们具有慢性感染的特点。
慢病毒的传染途径多样，可以通过血液、性接触、母婴传播等多种途径进行感染。
慢病毒感染后，会在体内潜伏数年甚至十几年，让感染者认为自己身体良好，但在这段时间里，感染者的健康却受到了慢性威胁。
本文将深入探讨慢病毒的感染机制及其防治策略。
一、慢病毒的感染机制1. 慢病毒的侵入过程慢病毒通过多种途径感染人体，其中血液途径是主要途径。
血液是慢病毒侵入人体的突破口。
在日常生活中，如注射毒品使用共享注射器、输血、器官移植、性行为等都会导致血液途径的感染。
2. 慢病毒的感染过程慢病毒的感染过程会受到许多因素的影响，包括病毒浓度、感染途径等。
慢病毒会侵入机体后，进入相关组织细胞，如巨细胞、淋巴细胞等，并在细胞内复制繁殖。
在慢病毒的复制过程中，它们会借助宿主细胞内的特殊机制，如表达特殊的病毒酶，使宿主细胞产生异常代谢，导致慢性病情的发生。
3. 慢病毒的传播慢病毒传播的途径多样，包括母婴垂直传播、血液途径传播、口腔黏膜摩擦等途径。
以乙型肝炎病毒为例，它能够通过血源、婴儿出生时从感染母亲的阴道中得到、疫苗接种时传染等多种途径传播。
二、慢病毒的防治策略1. 留意疫苗接种对于可预防的慢病毒而言，如肝炎B型和人类乳头瘤病毒疫苗，及时接种是精准预防的重要手段。
2. 定期筛查定期进行血液传染病筛查，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒等，可以及时了解自身健康状况，并采取必要的治疗措施。
3. 保证注射器个人使用分享注射器是造成共生性疾病感染的主要原因之一。
因此，在注射药物等行为时，使用个人注射器是非常重要的预防措施。
4. 适度运动和饮食慢病毒感染会使患者出现许多生理和情感问题，运动和饮食等健康生活方式会对提高机体免疫力、降低慢病毒产生和复制等防治病毒的重要作用。
总之，慢病毒是一类长期潜伏的病毒，它们的传播和繁殖方式都很特殊，因此我们需要充分了解和认识慢病毒的感染机制，才能更好地预防和治疗慢病毒相关疾病。
《慢病毒简介》课件
通过慢病毒将特定基因导入动物体内，建立人类疾病的动物 模型，用于药物筛选和疾病机制研究。
THANKS
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REPORTING
慢病毒载体可以携带特定疾病相关的 突变基因，用于建立疾病突变模型， 有助于深入了解疾病的发病机制和潜 在的治疗方法。
通过慢病毒感染，可以在动物模型中 过表达或敲除特定基因，以探究其在 疾病发生和发展中的作用。
PART 04
慢病毒的安全性
REPORTING
慢病毒的安全性评价
慢病毒在宿主细胞内的复制能力较弱，不会引起宿主细胞的恶性转化。
降低免疫原性。
在慢病毒基因治疗过程中，可以采取适 当的免疫抑制措施，以进一步降低免疫
排斥反应的风险。
慢病毒的致瘤性
尽管慢病毒具有较低的致瘤性，但仍存在一定 的风险。这主要是由于病毒基因组整合到宿主 细胞基因组中，可能导致细胞恶性转化。
在慢病毒基因治疗过程中，应选择适当的细胞 和组织类型，以降低致瘤性风险。同时，应密 切监测治疗过程中的细胞生长和分化情况。
包装过程中，细胞会合成重组 慢病毒的各组分，组装成完整 的病毒颗粒，并释放到培养液 中。
慢病毒滴度测定
慢病毒滴度测定是评估病毒液中病毒颗粒数目的过程，是慢病毒制备过程中的重要 环节。
滴度测定通常采用定量PCR、病毒计数或感染性滴度等方法进行。
通过滴度测定可以了解病毒液的浓度和纯度，为后续实验提供可靠的实验材料。
慢病毒在基因治疗领域的应用前景
罕见病治疗
利用慢病毒作为基因传递工具，将正常基因导入罕见病患者体内，实现基因治 疗。
遗传性疾病治疗
通过慢病毒将正常基因导入患者的造血干细胞或肝细胞等，实现遗传性疾病的 长期治疗。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒的病原学及其防治策略研究
慢病毒的病原学及其防治策略研究慢病毒（Slow Virus）是指一类病毒，其复制和感染速度较慢。
慢病毒可以引起较长时间的慢性感染，严重威胁着人类和动物的健康。
慢病毒病的病原学及其防治策略是当前医学和生物学研究的重点之一。
1. 慢病毒的病原学慢病毒主要分为三类：脑炎毒、免疫抑制毒和神经退行性毒。
其中，脑炎毒主要感染中枢神经系统，引起脑炎和脑膜炎等疾病；免疫抑制毒会抑制机体免疫功能，使机体容易感染其他病原体，引发各种慢性疾病；神经退行性毒则会引起神经系统退行性疾病，如痴呆和帕金森等。
慢病毒的病原学主要涉及慢病毒的复制和传播机制。
慢病毒的生命周期非常长，可以在宿主体内长期潜伏。
宿主感染慢病毒后，慢病毒会进入宿主的细胞中，经过一系列的复制和转录，在宿主体内慢慢扩散。
传播方式多种多样，可以通过血液、唾液、粪便等途径传播，也可以通过性传播和垂直传播传染给下一代。
2. 慢病毒的防治策略目前，预防慢病毒感染的最好方法是接种疫苗。
疫苗接种可以刺激机体产生免疫反应，增强机体免疫力，从而有效地预防慢病毒感染。
早期的乙肝疫苗接种就是一个典型的例子。
通过乙肝疫苗接种，全球乙肝病毒感染人数已经大幅度降低，降幅达到了90%以上。
另外，定期对宠物进行疫苗接种也是预防慢病毒感染的重要手段。
此外，强化宣传和教育也是预防慢病毒感染的有效途径。
我们可以通过各种媒体宣传慢病毒的预防知识，让人们了解如何预防慢病毒感染。
此外，定期组织大众参加健康讲座、义诊等活动，提高人们对慢病毒的认识水平和健康意识，积极推广健康生活方式，预防慢病毒感染。
另外，慢病毒的治疗主要是针对症状进行治疗。
因为慢病毒的治疗比较困难，迄今没有有效的特异性治疗方法，主要是对症下药。
例如，治疗免疫抑制毒感染的患者，重点是增强机体免疫力，通过增加细胞因子的产生和提高抗体水平等方法来治疗；而治疗神经退行性毒感染的患者，则主要是采用药物对症处理，缓解症状、延缓病情发展。
3. 思考与展望随着对慢病毒的研究深入，我们发现慢病毒的病原学和防治策略仍然存在很多未知的领域，需要我们继续深入研究。
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慢病毒——基因转移的潜在新载体用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。
目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,但是这些载体均存在不足之处,严重影响了基因治疗的有效性及安全性。
在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题,是无法高效转导非分裂期细胞,而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞,但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。
慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞,还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点,在基因治疗中具有广泛的应用前景。
现以HIV-1 为例,就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等方面作一综述。
一、慢病毒载体的生物学特征慢病毒包括灵长类慢病毒,如人类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。
目前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热门。
1.1 HIV-1 病毒形态与结构成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。
HIV-1的最外层为脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白,gp120为刺突,gp41为跨膜蛋白。
包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ,包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。
1.2 HIV-1 病毒基因组结构及其功能特征HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。
病毒基因组全长约9200bp ,含有gag、 pol、env3 个结构基因以及tat 、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu 6 个调节基因。
在病毒基因组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列,称为长末端重复序列(long terminal repeat ,LTR) 。
gag基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白 (p17) 和衣壳蛋白(p24) 。
pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env 编码gp120 和gp41 两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。
tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。
rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。
nef 基因编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。
vif 编码产物与病毒体的感染性有关,vpu 产物与病毒的装配、成熟和释放有关,而vpr 编码产物的功能尚不清楚。
1.3 HIV-1 生活史HIV-1 病毒通过gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性) ;最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。
病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。
1.4 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr 。
这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞核的前整合复合物( PIC)。
细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核孔蛋白。
importin-a含有一个细胞定位序列(NLS) 的结合位点,当含有NLS的蛋白与importin-a 结合在一起,发生构象变化,与importin-b 相互作用,然后importin-b通过与核孔蛋白结合,靶向作用于核孔复合物。
而在实际构建时,vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。
二、慢病毒载体的构建2.1 早期HIV21 来源的慢病毒载体早期构建的HIV21 来源的慢病毒载体,是作为研究HIV21生物特性的工具,而非作为基因转移载体。
该慢病毒载体包含了完整的病毒基因组,仅仅是在env 基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。
但是,这种载体可以应用于病毒的生物学研究。
2.2 第一代HIV-1 来源的慢病毒载体以Naldini以及Kafri构建的三质粒系统为代表。
该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。
载体质粒携带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。
其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。
包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动子/ 增强子元件取代。
为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点 (splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψ region) 删除,而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A)取代。
另外,利用点突变将env 编码序列打断,但仍然保留rev 反应元件。
这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。
env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。
本系统包膜质粒的改进之处在于,引入了VSV-G基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3个方面的积极意义: ①包膜的更换进一步降低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能; ②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞 ,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞; ③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。
使HIV-1 载体滴度由105 转录单位(TU) / ml 达到 108TU/ ml 。
这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步。
2.3 第二代HIV-1 来源的慢病毒载体尽管第一代载体产生RCR 的几率极小,仍然不能忽略产生的可能性。
毕竟包装质粒可以表达除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比如:vpr 可引起细胞周期停滞,vif能抑制某些细胞的生长而Nef 能引起凋亡。
1997年,Zufferey 等将包装质粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,从而得到第二代慢病毒载体,而其他方面与上述第一代载体系统一致。
研究发现即使全部 4 个调节基因都被敲除。
病毒颗粒的产量也不会受到影响。
这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、在体感染分化成熟大鼠神经元的能力,但是目前尚不能确定这种载体是否能转染全部种类细胞。
由于敲除的调节基因与野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力密切相关,所以这些载体即使发生多位点重组形成RCR ,亲代病毒仍不具有致病性。
2.4 第三代HIV-1 来源的慢病毒载体利用慢病毒来源的包装系统的最大问题在于生产过程中可能产生复制型病毒。
当质粒DNA 转染进入包装细胞,以及辅助质粒及载体质粒的RNA 包装入同一病毒颗粒时,将有可能发生重组。
减少这种可能性的方法之一就是减少辅助质粒与载体质粒的同源性。
另一个方法便是将gag/ pol 和rev 编码序列隔离,分散在不同的质粒。
这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统。
质粒一携带了gag/ pol 编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev 的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。
采用四质粒代替三质粒系统、除去tat 均减少了产生复制型病毒的可能性,从而增加了载体系统的安全性。
2.5 自身失活型(SIN) 慢病毒载体由于具有逆转录方式的特点,在逆转录过程中存在于病毒基因组3′端U3 区的启动子/增强子元件将被复制,并置于前病毒两端的LTR。
因此,3′LTR 的U3 区启动子发生失活突变后,将在逆转录过程中转移至5′LTR。
如果这样的载体整合入靶细胞,将不会产生完整长度的载体RNA ,因此命名为“自身失活型载体”。
这种技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒(SNV) 载体。
进一步研究表明 ,U3 区的频繁突变将导致病毒滴度下降,原因是该区域的某些序列是载体有效多聚腺苷酸化所必需的。
在HIV-1 基因组内,核心多聚腺苷酸化信号存在R 区。
现已证实,U3 区序列能影响多聚腺苷的酸化效率。
与MoMLV 相比,将HIV-1的3′LTRU3 区(除上述多聚腺苷酸化增强相关序列,以及病毒整合酶识别的U3 区5′末端外) 删除后并不会影响滴度。
这种删除能确保病毒RNA 逆转录并整合入靶细胞染色体后,从5′LTR 端启动子起始的复制被有效抑制。
这种设计的另一个优势是能增强瞬时表达效率,这可能与减少了病毒LTR 和细胞启动子之间的启动子竞争有关。
2.6 其它类型在改进慢病毒载体生物安全性的同时, 科学家们在基因转移效率方面对病毒载体做了一些改构,以期提高目的基因的转导效率及在靶细胞中的表达效率。
Zufferey 等将美洲旱獭肝炎病毒的翻译后调节元件(WPRE) 插至载体3′末端。
翻译后水平WPRE可以促进转录物出核,还可以通过上调初级转录物的多聚腺苷化,来增加胞内信使RNA 总量,最终改进转移基因的表达效率。
另外,科学家尝试在SIN 载体中修复118bp 的cPPT序列,发现在分化与非分化灵长类动物细胞中,载体转导效率显著提高。
三、慢病毒载体的包装大部分研发人员目前都使用瞬时转染293T 细胞的方式生产病毒载体。