指纹图谱及高效液相课件
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高效液相色谱法培训PPT课件
chromatography）。
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
8
手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类
5
离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
45
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
水不注
、 醋 酸 。
能 含 缓 冲 盐 ， 若 调 节
意
： 流 动 相 必 须 是 挥
pH
发
可性
用的
氨，
46
质 谱 检 测 器
47
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
1
第一节 概述
指纹图谱(PPT)
↓
↓
鉴别
质量评价
↓
↓
聚类分析
相似性差别
遗传算法
↓
人工神经网络
相似系数法
等等
夹角余泫法
欧氏距离等等
图 5 中药材、中药制剂药效组分指纹图谱信息处理研究框图
4、中药药效组分筛选及检测方法学
动态细胞培养 技术
电穿孔技术 ↘
细胞药物筛选 系统
↘
中药复方的有效 部位 ︱ ↓
中药复方药代动 力学
(血液、脑脊液)
三七总皂甙化学成分鉴定LCMS
the total saponins
Fr. III
Fr. II
Fr. IV
三七总皂甙化学成分
Fr.III-1中微量化合R1 物以HP分L析C制备
分离
100%CH3CN
R1
R1制备液相制备示意图
O OH
OH OH
OH
glc O
notoginsenoside R7
O OH
200
100
0 0
10
20
nm
mAU 800
VWD1
A,
Wavelength=203
(SANQI\A2112503.D)
700
600
500
400
300
200
100
0 0
10
nm 20
30 30 30 30 30
Carbosorb ODS-3
40
50
60
70
min
Lichosorb
40
50
60
70
min
Polaris
40
50
60
70
色谱指纹图谱评价PPT课件
面取得了显著进步。
毛细管电泳法（CE）
03
CE具有高分离效率和低成本的优势，尤其适合分析复杂生物样
品。
数据库的建立与完善
建立标准色谱指纹图谱库
收集各种样品的标准色谱指纹图谱，建立全面的数据库，为比对 分析提供参考。
数据标准化
对色谱数据进行处理和标准化，确保不同实验条件下的数据具有可 比性。
数据库更新与维护
谢谢观看
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的色谱柱， 确保目标成分的有效分离。
流动相的选择
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的流动相， 以获得最佳的分离效果。
检测波长的选择
选择适当的检测波长，以 便在指纹图谱中获得准确 的检测结果。
数据处理与分析
数据采集
按照设定的色谱条件进行实验 ，并采集色谱图数据。
色谱指纹图谱评价ppt课件
目录
• 引言 • 色谱指纹图谱的建立 • 色谱指纹图谱的解析 • 色谱指纹图谱的应用 • 色谱指纹图谱的局限性 • 色谱指纹图谱的发展趋势
01
引言
目的和背景
目的
介绍色谱指纹图谱在中药质量评价中的应用。
背景
随着中药产业的快速发展，中药质量评价方法的创新与改进成为行业关注的焦 点。色谱指纹图谱作为一种新型的中药质量评价方法，具有独特的优势和广泛 的应用前景。
数据预处理
对采集的数据进行必要的预处 理，如平滑化、基线校正等， 以提高数据的准确性和可靠性 。
特征峰的确定
通过对比对照品和样品色谱图 ，确定色谱指纹图谱中的特征 峰。
相似度评价
利用相关软件计算样品之间的 相似度，以评估色谱指纹图谱
的一致性和可靠性。
03
色谱指纹图谱的解析
高效液相色谱分析ppt课件
liquid-solid adsorption chromatograph
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
三、离子交换色谱
ion-exchange chromatograph
五、离子对色谱
ion-pair chromatograph
四、离子色谱
ion chromatograph
六、排阻色谱
size- exclusion chromatograph
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/9/23
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题： (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2019/9/23
1、离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
B2 Dm DmT
柱温T 低，流动相大B相忽略
2019/9/23
速率理论(与GC对比)
• 讨论：
• 1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next
电化学指纹图谱ppt课件
ຫໍສະໝຸດ 电化学指纹图谱用于中药定量分析
实验表明，特征参数诱导时间、最大振幅均能作为 定量分析的参数，均与甘草的用量呈良好的线性关 系。
面临的问题？？？
药材生产供应、流通领域的混乱对指纹图谱
的研究是不利的，用多种来源的药材很难制 定稳定的指纹图谱。 从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、 规范化程度不够，影响实验室之间的重现性。 除中药注射剂外，大部分中药制剂生产工艺 简单粗糙，杂质较多，即难以保证产品的稳 定，更无法提供高的质量。
不同粉末粒度的薄荷电化学指纹图谱(单位：mm)
(a)0.20~0.45 (b)0.15~0.20 (c)0.10~0.15 (d)0.075~0.10
电化学指纹图谱用于中药的鉴别
以上结果表明，不同中药作为底物的化
学振荡反应体系，可以获得各具特色的 中药电化学指纹图谱，可进行中药的鉴 别和检测。
电化学指纹图谱
常见的中药指纹图谱
高效液相色谱指纹图谱 气相色谱指纹图谱 薄层色谱指纹图谱 高速逆流色谱指纹图谱 毛细管电泳指纹图谱 红外光谱指纹图谱
色谱指纹图谱局限性
液相色谱仅适用于真溶液体系；气相色谱仅适用于 中药挥发性成分分析 定性和定量参数一般只有保留值和峰强度，色谱峰 形也很少变化，因而其特征直观性不强，需进行数 据处理后鉴别和评价中药； 色谱技术不能直接用于成药和固体天然药物指纹图 谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等 预处理，因而繁琐、操作流程长、试剂消耗量大， 分析费用高，还引入杂质，提取的部分已不能代表 中药的全部成分。 -------因此，色谱指纹图谱仅适用于中药注射液和口 服真溶液。
电化学指纹图谱
不加入中药时获得的纯B-Z振荡体系的E-t曲线， 因持续振荡时间超过4h，故只截取部分E-t曲线
实验表明，特征参数诱导时间、最大振幅均能作为 定量分析的参数，均与甘草的用量呈良好的线性关 系。
面临的问题？？？
药材生产供应、流通领域的混乱对指纹图谱
的研究是不利的，用多种来源的药材很难制 定稳定的指纹图谱。 从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、 规范化程度不够，影响实验室之间的重现性。 除中药注射剂外，大部分中药制剂生产工艺 简单粗糙，杂质较多，即难以保证产品的稳 定，更无法提供高的质量。
不同粉末粒度的薄荷电化学指纹图谱(单位：mm)
(a)0.20~0.45 (b)0.15~0.20 (c)0.10~0.15 (d)0.075~0.10
电化学指纹图谱用于中药的鉴别
以上结果表明，不同中药作为底物的化
学振荡反应体系，可以获得各具特色的 中药电化学指纹图谱，可进行中药的鉴 别和检测。
电化学指纹图谱
常见的中药指纹图谱
高效液相色谱指纹图谱 气相色谱指纹图谱 薄层色谱指纹图谱 高速逆流色谱指纹图谱 毛细管电泳指纹图谱 红外光谱指纹图谱
色谱指纹图谱局限性
液相色谱仅适用于真溶液体系；气相色谱仅适用于 中药挥发性成分分析 定性和定量参数一般只有保留值和峰强度，色谱峰 形也很少变化，因而其特征直观性不强，需进行数 据处理后鉴别和评价中药； 色谱技术不能直接用于成药和固体天然药物指纹图 谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等 预处理，因而繁琐、操作流程长、试剂消耗量大， 分析费用高，还引入杂质，提取的部分已不能代表 中药的全部成分。 -------因此，色谱指纹图谱仅适用于中药注射液和口 服真溶液。
电化学指纹图谱
不加入中药时获得的纯B-Z振荡体系的E-t曲线， 因持续振荡时间超过4h，故只截取部分E-t曲线
中药指纹图谱的原理与应用PPT课件
C联用。液相色谱可以起到脱盐和浓缩样品的作用，
减少盐或其它小分子对样品离子化的影响而降低样
品的损耗和污染。液相色谱与质谱在线联用使质谱
法与常规的蛋白质分析方法可以很好的联用，其精
确度和灵敏度都大大超过了常规方法。并且，快速
流动的在线分离技术是一种高效率的生物分析方法。
用LC/ESI/MS进行生物大分子的分析鉴定能获得满
第19页/共25页
• 现代分子生物学研究发现，核苷酸序列含有生命有机物构建、 维持和繁殖生命所必需的遗传信息，不同种生物体含有不同 的DNA序列，同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生 物体的遗传性状，又具有多态性，使同种生物各个体千差万 别。由于这种核苷酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代 分子生物学技术构建DNA指纹图。其原理是：每个生物体个 体的DNA经酶切后，电泳分离，用标记的DNA探针杂交和放 射自显影后形成的带纹分布应该是有区别的，具有个体、群 体和物种的特异性(DNA fingerprintion，DNAfp)。如要了 解中药复方制剂中的某味药是否存在，通过对这种中药材的 分子遗传标记的研究，找到具有该种高度特异性的片段，便 可以此为基础，制备出对该种高度特异性的寡核苷酸探针， 再经分子杂交进行指纹分析，即可达到鉴别目的。DNA指纹 图具有高度的个体特异性。DNA指纹图谱技术包括AP-PCR (arbitrary primer PCR，任意引物聚合酶链式反应)和RAP D(随机扩增多态性DNA，randomly amplified polymorp hic DNA)两种指纹图谱技术。RFLP (限制性[内切酶]片段长 度多态性，restriction fragment length polymorphism) 是最常用的构建DNA指纹图的方法，但该法费时费力，使应 用受到限制。随机扩增多态DNA(RAPD)标记，可以在特异D NA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中 药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。此外，还有SSR (简单重复序列，simple sequence repeat)、ISSR(简单重 复序列间区，inter s第im20p页l/共e 2s5e页quence repeat) 、AFLP(扩
11月指纹图谱PPT教学课件
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二、近代中药质量控制的发展 19世纪初至20世纪50年代为近
代中药质量控制发展阶段。 这一阶段逐步发展了显微鉴别、
基原鉴别及初期的理化鉴别。
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与药图的重要区别是，显微鉴别(镜) 可以深入到近微观层次研究生物的组织 结构，并暴露出各种细微结构特征，大 大增多了鉴别指标，虽然它本身仍然没 有深入到中药成分层次，但由于可利用 的组织结构指标增多，因而鉴别准确度 大大提高。
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中药质量控制的进展，由整体外在指标的 鉴别，发展到中药成分的质量控制；由零散的 个性化的鉴别方法，发展到全面的、系统的质 量控制体系。
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600
551
500
400
300
281
217
200
564 438 412
100
31 22 17
0
药材Ａ 及饮片
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特点： (1)通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品 的真伪或产地； (2)通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的 制订，能有效控制样品的质量，确保质量的 相对稳定。
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图1 小决明子生品的HPLC指纹图谱
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PPT教学课件
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中药质量控制进展
1
一、古代中药质量控制的发展
从中药形成至19世纪前后为 古代中药质量控制发展阶段中药质量控制的特点是以 药材的图形、形状大小、颜色、味、表 面特征、质地、断面等特征鉴别药材之 真伪。对部分药材亦辅以简单粗糙的理 化试验:如火烧、沉水、水浸、酒浸、荧 光、划痕等多种方法,针对性地鉴别不同 种类的药材。对制剂的质量控制，则认 为“丸散膏丹，神仙难辩”，只能以道 德修养和药房古训来约束。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
指纹图谱(PPT)
分布：主产云南文山、砚山、马关等地，广西 靖西、百色以及广东部分地区有产。
1年生
2年生
3年生
4年生
5年生
6年生
三七主根
其中云南省文山州占80%以上， 种植面积约5万亩，分布于文山 砚山、马关、麻栗坡、西畴等
三七药材资源分布图
三七GAP种植基地
化学成分研究：
已分离成分： 人参皂苷（ginsenoside）-Rb1、Rd、Re、
HO
O glc
20(S) 20( R)
notoginsenoside 8 notoginsenoside 9
glcO OH
OOH
HO
Oglc
notoginsenoside R10
HO
O glcO
OH
Oglc
glcO OH
notoginsenoside R1
OCH3
HO
HO Oglc
notoginsenoside R12
第三部分、三七系列中药注射剂指纹图谱研究及 相似度计算软件的试用。
研究单位：
中国药科大学 中国药品与生物制品检定所 中科院昆明植物研究所 广西药品检验所 上海市药品检验所 云南省药品检验所 广东省药品检验所 黑龙江省药品检验所 北京禾普康天然药物技术开发有限公司
研究的主要内容
➢ 三七药材GAP情况 ➢ 指纹图谱方法学研究 ➢ 三七药材指纹图谱研究、三七总皂甙生
500 400 300 200 100
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10
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mAU 500
VWD1
A,
(SANQI\A2112502.D)
Wavelength=203
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3年生
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三七主根
其中云南省文山州占80%以上， 种植面积约5万亩，分布于文山 砚山、马关、麻栗坡、西畴等
三七药材资源分布图
三七GAP种植基地
化学成分研究：
已分离成分： 人参皂苷（ginsenoside）-Rb1、Rd、Re、
HO
O glc
20(S) 20( R)
notoginsenoside 8 notoginsenoside 9
glcO OH
OOH
HO
Oglc
notoginsenoside R10
HO
O glcO
OH
Oglc
glcO OH
notoginsenoside R1
OCH3
HO
HO Oglc
notoginsenoside R12
第三部分、三七系列中药注射剂指纹图谱研究及 相似度计算软件的试用。
研究单位：
中国药科大学 中国药品与生物制品检定所 中科院昆明植物研究所 广西药品检验所 上海市药品检验所 云南省药品检验所 广东省药品检验所 黑龙江省药品检验所 北京禾普康天然药物技术开发有限公司
研究的主要内容
➢ 三七药材GAP情况 ➢ 指纹图谱方法学研究 ➢ 三七药材指纹图谱研究、三七总皂甙生
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VWD1
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指纹图谱
1. 1 色谱指纹图谱:
色谱指纹图谱包括TLCS、HPLC、GC、HSCCC和HPCE，主要应用的指纹图谱是GC和HPLC。
另外, HPCE指纹图谱研究也有着广泛的应用前景。
1.1.1高效液相色谱(HPLC)指纹图谱:具有适用范围广、选择性强、分离性能好、分析速度快、灵敏度高、样品用量少等优点，是一种评价天然药物真实性、稳定性和一致性的有效质量控制方法。
周玉新等[4]应用HPLC一DAD对三七药材、提取物及其注射液的皂昔类成分进行指纹图谱研究，获得三七药材、提取物及其注射液的具有专属性的三维指纹图谱。
翟为民等[5]应用HPLC一DAD对人参、西洋参和三七参进行了指纹图谱研究，采用梯度洗脱分离分析了其皂苷成分，可以有效的鉴别人参、西洋参和三七参。
1.1.2气相色谱（GC）指纹图谱：多用于天然药物中挥发性成分的测定,也有经衍生化反应后用于分析天然药物的其他成分如生物碱类、脂肪类、内脂类、酚类、糖类药物等。
梁倩等[6]建立了金银花药材挥发油的GC指纹图谱,并采用水蒸气蒸馏法提取、GC法分析对比了10批金银花药材挥发油的成分,结果表明, 10批金银花药材的挥发油相似度较高,该法可作为金银花药材的质量控制方法。
1.1.3高效毛细管电泳(HPCE)：季一兵[7] 等用50µm *50cm 未涂渍的毛细管柱, 20mmol/L硼砂溶液作缓冲液,运行电压为15kV,检测波长210nm, 建立了丹参中药材的HPCE 指纹图谱。
1.1.4、高速逆流色谱(HSCCC):顾铭等[8]采用HSCCC法, 以正己烷- 乙醇- 水体系采用分步洗脱, 建立了丹参药材中脂溶性成分的HSCCC 指纹图谱;。
指纹图谱PPT课件
质量稳定性评价结果 方法学考察：重现性、稳定性、精密度
光谱法
光谱法主要包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)和荧光光 谱(AFs)等3种方法。其中IR和UV是目前常用的2种用于中药指 纹图谱建立的方法。这2种方法对于成分简单的单昧药材具有 良好的鉴别效果，但由于其加和性，对于较为复杂的中药制剂 难以准确判断。
中药起药效的是有效物质群在发挥作用，不同的配伍将引起有效物质群 的该变。这种群体的变化可通过指纹图谱这种形式反映或表现出来。控 制好指纹图谱就可以获得良好的药效、稳定的质量和最佳的生物利用度。
中药指纹图谱的构建原则：
构建原则
系统性
特征性
稳定性 可操作性
中药指纹图谱的构建方法
中药化学指纹图谱
中药化学指纹图谱系指 采用光谱、色谱和其他 分析方法建立以表征中 药化学成分特征的指纹 图谱 光谱指纹图谱构建最常 用的是红外光谱（IR） 色谱最常用的是TLC、GC、 HPLC和CE
荧光光谱分析法 （AFS）
AFS的基本原理是蒸汽状态的原子因吸收能量而跃迁至高能态，并在这个过 程中发射出具有固定波长的荧光。
中草药因大多含有发光性组分而具有特征的荧光光谱。因此可利用发光标 记、被测物本身发光性质、分子组装、能量转移原理等分离鉴定药物有效成分。如 中药材的荧光鉴定、中药注射液等的药物鉴别、以及荧光分析及其连用技术用于测 定中药有效成分。
毛细管电泳仪及色谱图
HPLC高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展而成的。HPLC利用了气相色谱的理论和 方法。其工作原理是依据中药中各成分在展开剂和固定相之间分配系数的不同进行分离。HPLC受样 品本身和外界干扰的影响较小，非常适合用于中药指纹图谱的构建。HPLC具有仪器化程度高、分析 速度快、色谱柱可反复使用等优点，目前已成为指纹图谱研究的主要方法，应用十分广泛。 高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点： 〈1〉高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载 液加高压。
光谱法
光谱法主要包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)和荧光光 谱(AFs)等3种方法。其中IR和UV是目前常用的2种用于中药指 纹图谱建立的方法。这2种方法对于成分简单的单昧药材具有 良好的鉴别效果，但由于其加和性，对于较为复杂的中药制剂 难以准确判断。
中药起药效的是有效物质群在发挥作用，不同的配伍将引起有效物质群 的该变。这种群体的变化可通过指纹图谱这种形式反映或表现出来。控 制好指纹图谱就可以获得良好的药效、稳定的质量和最佳的生物利用度。
中药指纹图谱的构建原则：
构建原则
系统性
特征性
稳定性 可操作性
中药指纹图谱的构建方法
中药化学指纹图谱
中药化学指纹图谱系指 采用光谱、色谱和其他 分析方法建立以表征中 药化学成分特征的指纹 图谱 光谱指纹图谱构建最常 用的是红外光谱（IR） 色谱最常用的是TLC、GC、 HPLC和CE
荧光光谱分析法 （AFS）
AFS的基本原理是蒸汽状态的原子因吸收能量而跃迁至高能态，并在这个过 程中发射出具有固定波长的荧光。
中草药因大多含有发光性组分而具有特征的荧光光谱。因此可利用发光标 记、被测物本身发光性质、分子组装、能量转移原理等分离鉴定药物有效成分。如 中药材的荧光鉴定、中药注射液等的药物鉴别、以及荧光分析及其连用技术用于测 定中药有效成分。
毛细管电泳仪及色谱图
HPLC高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展而成的。HPLC利用了气相色谱的理论和 方法。其工作原理是依据中药中各成分在展开剂和固定相之间分配系数的不同进行分离。HPLC受样 品本身和外界干扰的影响较小，非常适合用于中药指纹图谱的构建。HPLC具有仪器化程度高、分析 速度快、色谱柱可反复使用等优点，目前已成为指纹图谱研究的主要方法，应用十分广泛。 高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点： 〈1〉高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载 液加高压。
第六章3高效液相色谱法 实用中药鉴定学课件(共15张PPT)
高效(ɡāo xiào)液相色谱法
▪ 高敏液相色谱法〔HPLC〕：采用高压输液泵将流动 相泵入装有填充剂的色谱柱进行别离测定的色谱方法。 注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内别离 后，先后进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理 系统记录色谱信号。
▪ 与气相色谱法相比较(bǐjiào)，具有适用范围广、流动 相选择性大、色谱柱可反复应用、流出组分易收集等 特点，适用于中药材及中成药的质量分析。HPLC法 的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同配比的混 合溶剂、缓冲液等液体溶液；常用色谱柱填充剂有硅 胶〔正相色谱〕、化学键合固定相〔如十八烷基硅烷 键合硅胶、离子交换树脂填料、凝胶等〕；
▪ 中药鉴定的依据：?中国药典?、?部颁药品 标准?及地方药品标准
11
第十一页，共15页。
▪ 中药鉴定的步骤：样品登记、取样(qǔyàng)、 鉴定〔真伪鉴定、杂质检查、浸出物测定和含 量测定、有害物质检查〕、填写鉴定报告书
▪ ?中国药典?〔2005年版〕分一部、二部和三 部及附录，共收载药品3214种，新增525种。 其中一部〔中药〕共载药1146种，二部〔化学 药品〕共载药1967种，三部〔生物制品〕共载 药101种。特点：理化分析手段先进，质量控 制评价全面，品种增删与时俱进，首创环保理 念，完善证病统一。
原子(yuánzǐ)吸收光谱法〔AAS〕
▪ 根据从光源辐射出的待测元素特征光波，通过供试 品蒸汽时，被蒸汽中的待测元素的基态原子(yuánzǐ) 所吸收，测定辐射光强度减弱的程度，而求出供试 品中待测元素含量的一种方法。
▪ 原子(yuánzǐ)吸收遵循一般分光光度法的吸收定律， 通过比较对照品和供试品的吸收度，即可求得供试 品中待测元素的含量。
▪ 本法具有专属性强，检测灵敏度高、测定速度快等 特点，是目前测定中药材及中成药中微量元素最常 用的方法之一。所用仪器为原子(yuánzǐ)吸收分光 光度计。
▪ 高敏液相色谱法〔HPLC〕：采用高压输液泵将流动 相泵入装有填充剂的色谱柱进行别离测定的色谱方法。 注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内别离 后，先后进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理 系统记录色谱信号。
▪ 与气相色谱法相比较(bǐjiào)，具有适用范围广、流动 相选择性大、色谱柱可反复应用、流出组分易收集等 特点，适用于中药材及中成药的质量分析。HPLC法 的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同配比的混 合溶剂、缓冲液等液体溶液；常用色谱柱填充剂有硅 胶〔正相色谱〕、化学键合固定相〔如十八烷基硅烷 键合硅胶、离子交换树脂填料、凝胶等〕；
▪ 中药鉴定的依据：?中国药典?、?部颁药品 标准?及地方药品标准
11
第十一页，共15页。
▪ 中药鉴定的步骤：样品登记、取样(qǔyàng)、 鉴定〔真伪鉴定、杂质检查、浸出物测定和含 量测定、有害物质检查〕、填写鉴定报告书
▪ ?中国药典?〔2005年版〕分一部、二部和三 部及附录，共收载药品3214种，新增525种。 其中一部〔中药〕共载药1146种，二部〔化学 药品〕共载药1967种，三部〔生物制品〕共载 药101种。特点：理化分析手段先进，质量控 制评价全面，品种增删与时俱进，首创环保理 念，完善证病统一。
原子(yuánzǐ)吸收光谱法〔AAS〕
▪ 根据从光源辐射出的待测元素特征光波，通过供试 品蒸汽时，被蒸汽中的待测元素的基态原子(yuánzǐ) 所吸收，测定辐射光强度减弱的程度，而求出供试 品中待测元素含量的一种方法。
▪ 原子(yuánzǐ)吸收遵循一般分光光度法的吸收定律， 通过比较对照品和供试品的吸收度，即可求得供试 品中待测元素的含量。
▪ 本法具有专属性强，检测灵敏度高、测定速度快等 特点，是目前测定中药材及中成药中微量元素最常 用的方法之一。所用仪器为原子(yuánzǐ)吸收分光 光度计。
DNA指纹图谱技术ppt课件
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
4、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）
此法与RFLP原理相同，只是在 PCR引物的一端用荧光染料进 行标记，这样使得限制片段长 度多态性图谱更为简化，只需 检测被标记的末端限制性片段， 就可以分析复杂群落。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度 凝胶电泳（TGGE）
步骤
（1）样品总DNA提取； （2）样品16S或18SrDNA片段的PCR扩增及纯化； （3）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶； （4）染色； （5）样品的DGGE分析； （6）割胶测序。
DGGE
10
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
其中16S、18S rRNA基因大小适中，不但含 有高度保守的基因片段，而且在不同的菌株间 也含有变异的核酸片段，因此其应用最为普遍。
一、核糖体RNA基因的介绍
利用rDNA测量细菌进化和亲缘关系
分析时可利用恒定区序列设计引物，将 16S rDNA进行PCR 扩增，产生长度相同但序 列有异的DNA片段混合物，然后利用可变区 序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分 离。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶 电泳（TGGE）
原理 在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极到负
极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中的 DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链 部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到 分离效果。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
除此以外，还有重复基因外回文序列PCR、核糖体间隔分析、编码蛋白质的基 因推测、质粒指纹图谱分析等现代分子生 物学技术研究方法，不需要对微生物进行 分离培养，克服了传统微生物培养技术的 局限性，能够客观分析，精确解释微生物 种类的多样性，给微生物生态学的研究带 来了光明前景。
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• （3)色谱联用技术，如气相色谱-质谱联用(GC-MS) 和液相色 谱-质谱(LC-MS) 等；
• （4)其他方法：电化学法、化学振荡技术、分子生物学方法等。 • 色谱法和色谱-质谱联用技术因其实用性较强而成为众多研究
方法中获取中药指纹图谱信息的主要手段。
不同检测方法会使分析的精密度、峰型、保留时间和分离度（即分离出的成分多少） 有所不同。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
查阅文献名称
• 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药
组分物质均一性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研
究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
中药指纹图谱研究意义
• 色谱、波谱以及光谱技术是实现指纹图谱对复杂样本质量控制 的依托；较于传统质量控制模式，指纹图谱体现的是复杂样本 整体化学成分的完整谱图，即复杂样本内在化学成分的整体性。 由于中药存在许多的次生代谢产物造成中药中各种化学成分组 成的不确定性，同一品种中药的化学指纹图谱会具有模糊性。 这两者作为指纹图谱的基本属性，它体现的不是个体的特异性 而是同一种中药群体的相似性，即中药内“共有特征”，能体 现指纹图谱的相似性；指纹图谱的解析不强调图谱的精密计算 和完全相同，而是强调图谱的准确辨认和相似。利用指纹图谱 作为中药质量控制技术，并不要求检测出中药中每一组分的化 学结构，但要求其图谱应具有“指纹”的特征，即要求其具有 专属性。同时，作为中药质量控制的有效方法之一，中药的化 学特征指纹图谱需具有重现性和可操作性。
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指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 1. 观察指纹图谱的整体特征，鉴别生产前原料真 伪，对原料药进行质量控制用以保证其质量的稳 定。
• 2. 可区别药材不同部位，还可对不同采摘期的药 材进行分析，确定最佳生长年限和采收季节。
究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的
含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
查阅文献名称
• 用HPLC指纹图谱对复方丹参片的信息质量控制研究—孙 国祥
• 3.中药材用高效液相色谱法分析时具体操作方法 • 4.高效液相色谱指纹图谱在具体成请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
指纹图谱的概述
• 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段， 它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主 要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真 实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性” 为其显著特点。
• 复方丹参片指纹图谱的质量评价研究—曾令杰 • 高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要
成分的含量—罗云 • 中药色谱指纹图谱研究及化学计量学方法的应用—徐小娜 • 青藏高原红景天药材的HPLC指纹图谱_李维卫 • 红景天活性成分及药理作用_袁瑜 • 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究_吴启
• 5. 可检测原料与成品之间及成品的批次间质量稳 定性。可规范生产工艺保证产品稳定性（对中间 体或半成品进行指纹图谱）。
• 指纹图谱技术利用中药特征指纹图谱的差异实现 中药真伪鉴别；而利用中药特征指纹图谱主要特 征峰的含量或比例实现中药质量的有效控制。
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勋
以上为主要查阅文献，还有一部分为选择性浏览或与以上文献有重复 内容故没有全部列出。
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查阅内容总结
• 1.对指纹图谱的初步认识及对其在中药学领域应 用的了解
• 2.根据今后实验方向重点了解高效液相色谱指纹 图谱在中药学领域的应用
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中药的高效液相指纹图谱分析方法
• 中药高效液相指纹图谱分析是以样品间色谱峰图 共有峰的不同峰面积和保留时间为对象进行比对 分析的。分析时大多结合药材，制剂有效成分所 在部位以相应溶剂提取该部位有效成分，而有些 制剂或药材用一种溶剂不能完全获取全部代表性 有效成分时则采用多色谱指纹图谱分析。以不同 溶剂提取获得多个色谱图。
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中药指纹图谱技术分类
• （1)色谱法，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色 谱(HPLC) 、高效毛细管电泳(CE)和高速逆流色谱(HSCCC) , 等；
• （2)波谱法，如红外光谱(IR) 和紫外-可见光谱(U-Vis)、X射线 衍射法以及核磁共振谱(NMR)等；
• 3. 指纹图谱可以考察商品药材及成药的质量，建 立各药材或成药的标准指纹图谱，可用于判断药 材优劣，区分正品与伪品。也可区别不同产地的 药材。
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指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 4. 可追踪制剂中某些化学成分的变化，可利用指 纹图谱考察中药中某些成分的稳定性。
• 指纹图谱中，各色谱峰所代表的物质的光吸收曲 线不可能相同，而物质含量检测的理想条件是获 得待测物质的光吸收曲线峰值或最大值，因此， 固定单波长下精确的检测色谱峰所代表的多种物 质含量是不可能的。
• 如果可以获得指纹图谱中个色谱峰的代表物质光 吸收峰值，就可精确测定这些物质的含量，而二 极管阵列检测器的应用使同时精确测定的多种物 质的含量成为可能。
• （4)其他方法：电化学法、化学振荡技术、分子生物学方法等。 • 色谱法和色谱-质谱联用技术因其实用性较强而成为众多研究
方法中获取中药指纹图谱信息的主要手段。
不同检测方法会使分析的精密度、峰型、保留时间和分离度（即分离出的成分多少） 有所不同。
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查阅文献名称
• 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药
组分物质均一性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研
究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
中药指纹图谱研究意义
• 色谱、波谱以及光谱技术是实现指纹图谱对复杂样本质量控制 的依托；较于传统质量控制模式，指纹图谱体现的是复杂样本 整体化学成分的完整谱图，即复杂样本内在化学成分的整体性。 由于中药存在许多的次生代谢产物造成中药中各种化学成分组 成的不确定性，同一品种中药的化学指纹图谱会具有模糊性。 这两者作为指纹图谱的基本属性，它体现的不是个体的特异性 而是同一种中药群体的相似性，即中药内“共有特征”，能体 现指纹图谱的相似性；指纹图谱的解析不强调图谱的精密计算 和完全相同，而是强调图谱的准确辨认和相似。利用指纹图谱 作为中药质量控制技术，并不要求检测出中药中每一组分的化 学结构，但要求其图谱应具有“指纹”的特征，即要求其具有 专属性。同时，作为中药质量控制的有效方法之一，中药的化 学特征指纹图谱需具有重现性和可操作性。
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指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 1. 观察指纹图谱的整体特征，鉴别生产前原料真 伪，对原料药进行质量控制用以保证其质量的稳 定。
• 2. 可区别药材不同部位，还可对不同采摘期的药 材进行分析，确定最佳生长年限和采收季节。
究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的
含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
查阅文献名称
• 用HPLC指纹图谱对复方丹参片的信息质量控制研究—孙 国祥
• 3.中药材用高效液相色谱法分析时具体操作方法 • 4.高效液相色谱指纹图谱在具体成请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
指纹图谱的概述
• 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段， 它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主 要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真 实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性” 为其显著特点。
• 复方丹参片指纹图谱的质量评价研究—曾令杰 • 高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要
成分的含量—罗云 • 中药色谱指纹图谱研究及化学计量学方法的应用—徐小娜 • 青藏高原红景天药材的HPLC指纹图谱_李维卫 • 红景天活性成分及药理作用_袁瑜 • 青藏高原红景天药材的高效液相色谱指纹图谱研究_吴启
• 5. 可检测原料与成品之间及成品的批次间质量稳 定性。可规范生产工艺保证产品稳定性（对中间 体或半成品进行指纹图谱）。
• 指纹图谱技术利用中药特征指纹图谱的差异实现 中药真伪鉴别；而利用中药特征指纹图谱主要特 征峰的含量或比例实现中药质量的有效控制。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
勋
以上为主要查阅文献，还有一部分为选择性浏览或与以上文献有重复 内容故没有全部列出。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
查阅内容总结
• 1.对指纹图谱的初步认识及对其在中药学领域应 用的了解
• 2.根据今后实验方向重点了解高效液相色谱指纹 图谱在中药学领域的应用
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
中药的高效液相指纹图谱分析方法
• 中药高效液相指纹图谱分析是以样品间色谱峰图 共有峰的不同峰面积和保留时间为对象进行比对 分析的。分析时大多结合药材，制剂有效成分所 在部位以相应溶剂提取该部位有效成分，而有些 制剂或药材用一种溶剂不能完全获取全部代表性 有效成分时则采用多色谱指纹图谱分析。以不同 溶剂提取获得多个色谱图。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
中药指纹图谱技术分类
• （1)色谱法，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色 谱(HPLC) 、高效毛细管电泳(CE)和高速逆流色谱(HSCCC) , 等；
• （2)波谱法，如红外光谱(IR) 和紫外-可见光谱(U-Vis)、X射线 衍射法以及核磁共振谱(NMR)等；
• 3. 指纹图谱可以考察商品药材及成药的质量，建 立各药材或成药的标准指纹图谱，可用于判断药 材优劣，区分正品与伪品。也可区别不同产地的 药材。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
指纹图谱在评价中药质量中的作用
• 4. 可追踪制剂中某些化学成分的变化，可利用指 纹图谱考察中药中某些成分的稳定性。
• 指纹图谱中，各色谱峰所代表的物质的光吸收曲 线不可能相同，而物质含量检测的理想条件是获 得待测物质的光吸收曲线峰值或最大值，因此， 固定单波长下精确的检测色谱峰所代表的多种物 质含量是不可能的。
• 如果可以获得指纹图谱中个色谱峰的代表物质光 吸收峰值，就可精确测定这些物质的含量，而二 极管阵列检测器的应用使同时精确测定的多种物 质的含量成为可能。