临床检验主管技师 临床免疫学和免疫检验 第六章 沉淀反应

第六章沉淀反应

沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。

第一节沉淀反应的特点

沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。

沉淀反应分两个阶段，

第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；

第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

第二节液体内沉淀试验

一、絮状沉淀试验

抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：

（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。

（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。

（三）方阵滴定法即棋盘滴定法。

二、免疫浊度测定

属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。

（一）免疫比浊测定的影响因素

1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。

当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。

在反应体系中需保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。

2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求

（1）特异性强

（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。

（3）亲和力强：则抗体的活性高，可加快抗原抗体反应的速度，且形成的IC较牢固，不易发生解离。

（4）R型和H型抗体：

R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。

H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离。

3.抗原抗体反应的溶液

反应液最适pH为6.5～8.5。常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。

在一定范围内，离子强度大，IC形成越快。

4.增浊剂

某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20，其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。

（二）免疫比浊法方法分类

1.透射免疫比浊法通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化，来定量抗原抗体的复合物。

2.散射免疫比浊法通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。

3.免疫胶乳比浊法是以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。

第三节凝胶内沉淀试验

利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。

凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，借此可用以识别不同待测物分子量的差别。

一、单向扩散试验

在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。

（一）试管法将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液，使其自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。

（二）平板法是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖凝胶内，制成平板，在上打孔，将抗原加入孔中，37℃行自由扩散，24～48小时后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。有两种计算方法：

1.Mancini曲线适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果，沉淀环直径的平方（d2）与抗原浓度（c）呈线性关系：c/d2＝k。

2.Fahey曲线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数纸画线，浓度对数logc与扩散环直径（d）呈线性关系：logc/d＝k（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）。

（三）影响因素

1.抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。

2.每次测定都必须作标准曲线。

3.每次测定时必须用质控血清作质控。

4.注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。

二、双向扩散试验

让抗原和抗体在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成沉淀线，可对抗原或抗体进行定性分析。

双向扩散试验灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。

（一）试管法抗体——琼脂——抗原

（二）平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。

1.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计

（1）沉淀线靠近抗原孔，则抗体含量较大；

（2）沉淀线靠近抗体孔，则抗原含量较大；

（3）不出现沉淀线则无对应的抗体（抗原）或者抗原过量。

2.抗原或抗体相对分子量的分析

（1）分子量小者扩散快，反之则较慢。

（2）由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方；如果两者分子量大致

相等，则形成直线。

3.抗原性质的分析

（1）两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，两个抗原相同；

（2）沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同；

（3）两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同。

4.抗体效价的滴定

固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。

5.抗原或抗体纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线说明不纯。

第四节免疫电泳技术