基因工程实验与理论总结

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。

2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？

EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。

酚:使蛋白质变性。

氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。

无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。

Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。

70％乙醇:清洗溶液中离子及其他杂质。

NaCl:提供高盐环境，使DNA溶解于液相中。

2.有机溶剂使用注意事项？

答：①有机溶剂的容器，不论是否在使用中，都应随手盖紧。

②尽可能在通风位置工作，以避免吸入有机溶剂的蒸汽。

③尽可能避免皮肤直接接触。

3.PCR原理？

答：将目的基因DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（40~60℃）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65~75℃）下，由耐热的DNA聚合酶(Taq酶）将dNTP 中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5，→3，方向延伸，合成一条新的互补链。

4.PCR类型？反转录PCR怎么做的?

答：反向PCR、巢式PCR、锚定PCR、数字PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫捕捉PCR等。

RT-PCR的原理：提取组织或细胞中的总RNA，以ployA（A）+选择性RNA为模板采用oligo(dT)、随机引物或基因特异性的引物GSP经反转录酶的作用从RNA合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。

5.PCR影响因素？

答：引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反应缓冲液。

6.PCR体系有什么物质？作用？

答：①引物：是两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸，使DNA聚合酶以其3，-OH末端为起点合成互补链，决定了特定基因的扩增。

②模板：提供DNA复制的模板，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子。

③TaqDNA聚合酶：将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5，-3，方向延伸，合成一条新的互补链。

④底物dNTPmix：4种脱氧核苷酸，提供PCR反应的原料和能量。

⑤反应缓冲液：反应缓冲液一般含有Tris-HCl、KCl和适当的Mg2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，Tris-HCl起缓冲作用，KCl有利于引物的退火。

7.怎样提高PCR产物的特异性？

引物:a.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。b.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。c.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。d.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。e.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。f.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

Mg2+:浓度通常为0.5—2.0mmol/l，过高或过低均影响产物的特异性。

模板:模板量应适宜，过量则可能增加非特异性。

延伸时间:应适宜，时间过长会导致产物非特异性增加。

循环次数:一般为30个（25—30个）周期，如果循环次数过高，会增加非特异性产物及其复杂度。

8.PCR都有哪些酶可以用？

答：TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。见实验书69页。

9.T4 DNA连接酶连接的原理？

答：T4 DNA连接酶作用机制：酶先与A TP形成酶-AMP共价复合物，再与DNA作用、AMP 转移至DNA缺口5，-磷酸基上形成焦磷酸键而活化5，-磷酸基，然后再与3，-羟基形成磷酸酯键，完成连接过程。

10.PCR产物与T载体怎样连接的？

答：PMD18-T质粒0.5uL，PCR产物4.5uL，2×solution（含T4DNA连接酶）5uL，混匀后16℃水浴过夜。

11.DNA用试剂盒是怎么回收纯化得到的？

答：依据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附DNA，在低盐浓度下可被洗脱的原理。按照100mg胶块加入700uL溶胶液的比例，55℃溶胶。将融化的胶溶液转移到吸附柱中，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管，加漂洗液离心洗涤，重复漂洗一次，去掉废液后放回吸附柱空转，尽量去除多余溶液。再将吸附柱放入新的收集管中加入洗脱液，静置离心后去掉吸附柱，即为纯化产物。

12.DNA回收的注意事项?

答: ①加入的胶块溶化液的量要足量，保证胶能完全溶解，避免堵塞硅胶模

②确保WB液中已经加入了酒精

③把胶液倒入柱子后要静止2min以后再离心，使DAN完全吸附于膜上

④洗脱液要滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

⑤将离心后的洗脱液倒掉后，要在空离心。

13.连接为何在16℃？

答：因为黏性末端的DNA双键间有氢键的作用，温度过高使氢键不稳定，但连接的最适温度恰为37℃，所以经综合考虑，采用16℃较为合适。

14.载体与目的基因连接时各自的量有什么讲究？

答：连接时外源基因的量要多一些，载体的量要少一些，这样碰撞的机会就会多，否则载体自身环化就严重，一般载体DNA与目的基因连接采用1:(1-3）的比。连接酶的用量不宜过