KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失衡的影响

KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失

衡的影响

目的研究ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖过程的影响，以及细胞因子信号转导抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表达变化与转化生长因子-β1（TGF-β1）分泌释放水平的关系。方法体外构建增殖型ASMCs原代培养细胞模型，分为ASMCs组、AngⅡ·ASMCs组、淋巴细胞（L）组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。Real-time PCR检测细胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表达的差异；ELISA法检测上清液中TGF-β1的释放水平。观察KATP通道开放剂尼可地尔（NCR）干预的影响。结果与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平明显升高（P＜0.01）；NCR作用于细胞后各组ASMCs表达TGF-β1与格列本脲（GLI）比较明显减少（P＜0.05）。与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs+L组SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P＜0.05）。NCR可以下调SOCS3的表达，上调SOCS5的表达。结论KATP通道开放可以通过抑制ASMCs增殖而调控TGF-β1分泌表达；SOCS3和SOCS5可能是哮喘气道重塑的特异性免疫治疗中的重要靶点。

标签：KATP通道开放剂；气道平滑肌细胞；细胞因子信号转导抑制因子；哮喘

细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年来新发现的一类负向调节因子[1]，参与多种细胞因子信号转导过程，其中SOCS3和SOCS5作为SOCS家族的重要成员，可能与哮喘等免疫性疾病的发生、发展有关，并有望成为这类疾病的治疗靶点。有研究说明[2]，ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对哮喘的气道重塑可以产生有益的作用，其机制尚未见系统性的研究报道。本研究利用在体外原代培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP 通道开放剂的作用是否与逆转气道平滑肌细胞增殖有关，以及对SOCS3/5免疫失衡的影响，为治疗哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

淋巴细胞分离液，购自碧云天；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司；α-肌动蛋白（α-SMA）单抗，购自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA试剂盒，购自伊莱瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培养基，购自美国Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙据制药股份有限公司；尼可地尔（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro医药公司；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型胶原酶（collagenase Ⅰ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及鉴定雄性SD大鼠，SPF级，年龄21～36 d，体重100～140 g，由三峡大学实验动物中心提供。方法参考相关文献进行改进[3]。以10%的水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，放入超净台中，开胸取出气管，刮去外膜内膜，D-Hank′s液洗净，剪碎、消化后，用20%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，5%CO2培养箱中37℃静置培养1周左右，可见细胞从组织块周围爬出。实验用3～6代细胞，免疫细胞化学染色鉴定平滑肌细胞上特有的α-SMA。

1.2.2 AngⅡ诱导ASMCs的增殖与表达AngⅡ（100 nmol/L）处理ASMCs，连续作用3 d，24 h换一次液；Western blotting检测α-SMA，评定AngⅡ对ASMCs 增殖诱导作用；上清中TGF-β1分泌表达用ELISA检测（按说明书操作），分为ASMCs组和AngⅡ·ASMCs组。

1.2.3 AngⅡ·ASMCs与淋巴细胞共培养以AngⅡ处理ASMCs后，D-Hank′s 液洗3遍，消化重悬，以1×106 cell/L铺于6孔板中，待细胞贴壁生长24 h，加入提取的2 ml T淋巴细胞（1×105 cell/L），作用36 h，分为L组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。

1.2.4 Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5在共培养体系中的表达①收集上清中的淋巴细胞，（5～10）×106单个核细胞加Trizol 1 ml，混匀后Trizol法提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA含量。②RT-PCR反应体系：RNA 4.0348 μg，Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ddH2O（RNAse free）至14.5 μl，70℃ 5 min，短暂离心后置于冰上；以上PCR管全部14.5 μl，5×RT 缓冲液4 μl，HRP（RRI）/RNAse Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，ddH2O（RNAse free）至20 μl，42℃60 min，95℃5 min。③Real-time PCR反应体系：β-actin f （10 μmol/L）0.5 μl，β-actin r（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，Ex Taq 0.25 μl，10×Ex Taq E缓冲液2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O至25 μl，94℃4 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃25 s，30个循环，72℃4 min，4℃4 min，引物序列及扩增条件见表1。表1 Real-time PCR反应的引物序列及扩增条件

1.2.5 KATP通道调节剂处理细胞NCR（开放剂）处理ASMCs以及共培养组细胞，并以DEX（治疗药）和GLI（拮抗剂）分别作为阳性对照和阴性对照。加药后细胞培养36 h，每12小时换一次液。Real-time PCR检测SOCS3和SOCS5的表达差异；上清中TGF-β1分泌表达用ELISA检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果