工业微生物化学诱变育种研究及应用进展

　[收稿日期]2008-05-18

　[作者简介]欧平(1970-),男,广西贺州学院讲师,微生物专业在读硕士。主要研究方向:微生物学。

工业微生物化学诱变育种研究及应用进展

欧　平

(贺州学院,广西　贺州　542800)

[摘　要]文章着重介绍了当代化学诱变技术、发生突变的机理和诱变效率,概述了化学诱变的原理及

其在工业微生物育种上的应用进展,选择性地介绍了几种公认有效的突变剂的作用机理。

[关键词]微生物;化学诱变;诱变剂

[中图分类号]Q933　[文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2008)03-0139-06 变异是生物进化的基础推动力(Stebbins 1950),也是保证物种多样性的前提,是其他任何方式不能代替的重要演变方式。人为地利用这种方式,用尽可能小地影响基础生命代谢的方式最大限度地追求对物种变异的加速,正是诱导变异的研究目的。诱变育种是人为地利用诱变因素诱发生物遗传变异,在较短时间内获得有利用价值的突变体,根据育种目标要求,选育成新品种直接生产利用,或育成新种质作亲本在育种上利用的育种途径。诱变育种对于品种的改良有着很大的贡献,而在生物的生理机制研究中,诱变技术也功不可没,许多代谢途径的发现都是建立在若干突变体的基础上的。随着分子水平的深入研究,与诱变相关的基因um u D 、C 和di n B 的克隆,以及其他突变机理的进一步明晰,诱变育种的工作变得更为有序和可操纵。

1927年,Muller 发现X 射线能诱发果蝇基因突

变,从此开创了诱变育种技术的先河。诱变育种技术发展至今形成了3种技术:辐射诱变、定点诱变和化学诱变。世界化学诱变育种研究工作始于20世纪50年代,我国近几十年来这方面的研究工作也有了较大进展。20世纪70年代以来,诱变因素从早期的单一诱变剂发展到多种化学诱变剂和生理活性物质,诱变方法从单一处理发展到复合处理,同时,诱变育种与组织培养等密切结合,大大提高了诱变育种的实际意义。

从自然环境中分离,经过简单筛选而获得的的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力,但是要达到某种特定代谢产物的大量积累,实现高产、优质和低

耗的高效转化,则需要对菌株进行改良,解除或突破微生物的代谢调控[1]。微生物育种手段主要有:诱变育种、杂交育种和基因工程育种。虽然现代的基因操作技术对菌株改造更为精准,但实际工业化生产上所使用的产酶菌株,仍然是多采用一些传统诱变技术。诱变育种就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群,在大大提高其突变频率的基础上,采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株,以供科学实验和生产实践使用[2]。由于化学诱变育种技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点,因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。经过近一个世纪的不断发展和完善,化学诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用、最有效的技术之一。

1.化学诱变的主要原理

化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的,它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复,产生突变体。这些突变以点突变为主,并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。单一碱基对改变而形成的点突变是化学诱变的主要形式。

化学诱变剂主要指某些烷化剂、碱基类似物、抗

生素等化学药物,常见的有甲基磺酸乙酯(EMS )、硫酸二乙酯(DES )、叠氮化钠(SA )和乙烯亚胺(EI )等,这些化合物通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用[3]。

其中烷化剂因可与核酸的碱基等直接发生化学

反应,在复制时导致碱基错配,故更易引起基因突变,常用的有亚硝基胍(N TG)、硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亚胺和环氧乙酸等。一般来说处理剂量大,致死率高,单位存活的正突变菌株少,但是在不多的正突变菌株中可能会有目的产物产量大幅提高的突变株;处理剂量小,致死率低,单位存活的正突变菌株虽多,但一般目的产物产量提高不大,并且由于正突变菌株量过多,会大大增加复筛的工作量。不过因为各种诱变剂各有其特殊性、致死和变异作用并非同一过程的平行效应且有些菌株只对某些特定的诱变剂敏感,所以对诱变剂的选择很大程度上依赖于经验以及最初在实验室所做的尝试性工作。

化学诱变的特点:突变频率比自然突变高几百倍至几千倍,且变异谱广泛;由诱变引起的断裂与重接,可打破优良性状与不良性状间的连锁;能比较有效地提高个别微生物的产酶量;育种程序简单,年限短;变异的方向和性质不定;诱发的变异较易稳定;使用经济方便,只需少量的药剂和简单的设备。

不同诱变剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。在选择诱变剂时,还要考虑下列标准:诱变剂的有效性、效率和专一性,这是解决定向突变的一条途径。

化学诱变剂在微生物上的应用一般认为始于上世纪中,通过近几十年的研究,人们对诱变原理的认识也逐步加深。我们知道,常规杂交育种基本上是染色体的重新组合,这种技术一般并不引起染色体发生变异,更难以触及到基因。而利用化学诱变,有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子,也有的本身是核苷酸碱基的类似物,它可以“鱼目混珠”,造成DNA复制中的错误,无疑这些都会使微生物的基因发生突变。化学因素的诱导作用使得细菌的突变率比平时高出千百倍,有些变异是其它手段难以得到的。可遗传的优良性状一经获得便可育成品种或种质资源。

2.化学诱变在工业微生物育种上的研究与应用

2.1　化学诱变育种技术

化学诱变剂与物理辐射相比在作用方式上和生物学效应的均有较大差异[4],其优势主要有以下几个方面:第一,化学诱变剂靠各自的活性基团和特有的化学特性直接与生物分子进行化学反应,是化学基团之间的反应,更多的是引起分子水平上的变化,对生物分子的影响是个别、局部的,不利作用少[5];第二,化学诱变剂引起的突变频率较高,尤其是产生非常高的叶绿素突变频率[6],就突变的数量而言要

比辐射有效得多;第三,化学诱变剂有特异性,遗传变异定位的程度比辐射高,诱发的突变性状有明确的专一性。此外,化学诱变剂很经济,用量少,操作方便。

化学诱变育种是通过化学诱变剂诱发微生物基因或染色体畸变,经过培育和筛选,育成产酶量高的品种的新方法。其优点是突变遗传性状稳定快,可以缩短育种进程。化学诱变育种的一般步骤为:出发菌株叶纯化→斜面培养→单细胞或单孢子悬液→诱变剂处理→平板分离→斜面培养→初筛→斜面培养→复筛→斜面培养→中试→生产实践。

2.2　化学诱变育种工作的原则

2.2.1　选择简便有效的诱变剂。

2.2.2　挑选优良的出发菌株(即用于育种的原始菌株)。

2.2.3　处理单细胞或单孢子悬液,使呈分散状态,均匀接触诱变剂。细菌或酶母菌悬液中加玻璃珠并振荡,或用脱脂棉过滤,可获均匀分散的单细胞悬液。放线菌和霉菌的菌丝是多核的,诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液,常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80),浓度0.01%～0.1%。

2.2.4　选用最适剂量:在高诱变率的前提下,既能扩大变异幅度,又能促使变异移向正变范围的剂量,即为最适剂量。

2.2.5　利用复合处理的协同效应:两种或多种诱变剂的先后使用,同一种诱变剂的重复使用,两种或多种诱变剂的同时使用,均常呈现一定的协同效应,会取得更好的诱变效果。

2.2.6　利用微生物形态、生理与产量间的相关指标,如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等,以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。

2.2.7　设计和采用高效筛选方案和方法,以期花费最少的工作量,在最短的时间内,取得最大的成效。

2.3　化学诱变技术突变机理及诱变效率

2.3.1　化学诱变中DNA损伤、修复系统与适应性突变

自然条件下,损伤和发生复制差错的频率都是很高的。Ames[7](1989)对鼠肝脏因氧化作用引起的损伤作了统计,核基因组每130000bp有1个损伤,线粒体中每8000bp有一个碱基损伤。DNA复制的错误包括转座、倒位、移码和丢失。Haynes和Kunz(1988)报道,复制错误频率大约是10-2,即:“每一个复制的基因中会出现一个错误”。尽管这些