液相色谱-串联质谱法测定饮用水中的丙烯酰胺

液相色谱-串联质谱法测定饮用水中的丙烯
酰胺
张凌云1刘波1徐荣1卢益新1谭美凌1赵宇1 伍子同2
（1 深圳市水务集团水质监测站深圳 518000;
2 武汉理工大学理学院化学系武汉 430070）
摘要建立了用液相色谱-串联质谱法测定饮用水中丙烯酰胺的方法。

该法使用Cole-Parmer PTFE滤膜过滤样品，采用Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm)柱分离，以0.1%甲酸和甲醇为流动相（体积比95：5）分离。

采用UPLC/MS/MS电喷雾电离正离子模式（ESI+），多反应检测（MRM），以外标法定量分析。

该方法在0.10μg·l-1到0.60μg·l-1有良好线性范围。

最低检测下限（LOD）0.10μg·l-1。

加标回收率范围为88.9%-106.7%。

相对标准偏差均低于8.2%。

方法适用与水中丙烯酰胺的测定，具有灵敏度高、重现性好的特点，在水质监测中有重要作用。

关键词质谱,LC/MS/MS,丙烯酰胺,饮用水,外标法。

1 引言
丙烯酰胺（Acrylamide）是一种水溶性小分子白色结晶状固体（图1），溶于水，乙醇等极性有机溶剂，是聚丙烯酰胺的单体。

聚丙烯酰胺在水处理中用作絮凝剂，在饮用水的处理中有助于水的澄清。

丙烯酰胺已被国家癌症中心（IARC）列为IIA类致癌物[1]，它的α，β-不饱和氨基系统非常容易与亲核物质通过迈克尔加成（Michael addition）发生化学反应，从而影响蛋白质的正常功能而致病[2]。

急性毒性实验证明丙烯酰胺有神经毒性[3]、生殖、发育毒性[4]。

动物实验证明丙烯酰胺可导致遗传物质的改变和癌症的发生。

由于丙烯酰胺单体可导致生物遗传物质的改变及引起癌症，并且有神经毒性，世界卫生组织规定饮用水中的丙烯酰胺最高限量不超过0.5μg·l-1 [5].因此，有必要建立一种合适的测定方法以检测饮用水中的低含量丙烯酰胺。

丙烯酰胺极性很强，在常温下易分解[6]。

目前，国内外测定痕量丙烯酰胺的方法主要有高效液相色谱法、气-质联用法及衍生化法[7-9],但不适用于测定水中的丙烯酰胺。

而测定水中痕量丙烯酰胺有液相色谱-串联质谱联用法[10]、高效液相色谱法[7]。

但是这些方法测定步骤繁琐、灵敏度低、不能满足大多数实验室的检验要求。

本论文陈述了使用液相色谱-串联质谱法测定饮用水中的丙烯酰胺的方法，该法有前处理简单、测定周期短、灵敏度高、重现性好等优点。

图1 丙烯酰胺的结构式与化学性质
Fig.1 Chemical structure and properties of acrylamide
2 实验部分
2．1实验仪器、试剂与样品
2．1．1 仪器
Waters Acquity 超高液相色谱仪(配备自动进样器、二元梯度泵)；Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm)色谱柱；Micromass Quattro Premier XE四级杆串联质谱仪；Barnsted超纯水器；AND AF-2000十万分之一电子天平。

2．1．2 试剂
纯水制备自Barnsted超纯水器，电导率为18.2MΩ,TOC<0.2PPM,并去热源；丙烯酰胺固体标准品购自Cxbio Biotech.；丙烯酰胺液体标准品浓度1000μg·ml-1，溶剂为甲醇，购自美国百灵威；甲醇（HPLC级，德国Merck公司）
2．2 实验条件
2．2．1 色谱条件
色谱柱：Waters Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm);柱温：30℃；流动相：甲醇-水（0.1%甲酸），体积比5：95；进样量10μl；流速：0.25ml·min-1。

2．2．2 质谱条件
离子源：ESI+模式；毛细管电压：3.50kV;锥孔电压：20V;二级锥孔电压：5V;源温：120℃;脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流速：400L·h-1；定量方式为多反应检测（MRM）模式，定量离子为丙烯酰胺（71.6>54.8）,定性离子为丙烯酰胺（71.6>43.9），碰撞能量均为8eV。

2．2．3 样品预处理
分析前，样品于4℃避光保存。

分析时，样品用Cole-Parmer PTFE 0.2μm滤膜过滤。

2．2．4 定性及定量
选择m/z71.6>54.8作为样品的定量离子，m/z 71.6>43.9作为样品的定性离子；以m/z 71.6>54.8的峰面积比对丙烯酰胺的质量浓度作标准曲线。

以保留时间和m/z71.6>43.9的响应强度比作为定性标准。

3 结果与讨论
3．1实验条件优化
3．1．1 液相色谱条件的优化
丙烯酰胺有较强的水溶性，因此选择纯水作为主要流动相，为了增加电离效果可以加入少量甲酸，但甲酸加入后会改变流动相PH值，酸性太强会大大降低色谱柱的使用寿命，因此选择0.1%的甲酸水溶液作为主要流动相。

但须注意甲酸溶液必须临用新配并密封放置半小时后使用。

实验对比研究BEH C18（1.7μm 2.1X50mm）柱与Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm)柱在分离度与灵敏度上的差异，发现采用Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm)柱有相对较长的保留时间并且信噪比和灵敏度都有所高，而且可以改善拖尾现象。

对比分别使用0.1%甲酸水溶液与水（0.1%甲酸）-甲醇（体积比95：5）为流动相时保留时间、响应强度、峰形的差异，发现使用0.1%甲酸水溶液保留时间增大，两者响应强度无较大差别，但使用甲醇可改善峰形。

经过综合考虑，采用水（0.1%甲酸）-甲醇（体积比95：5）为流动相，流速：0.25ml·Min-1，在2分钟内可较好地分离丙烯酰胺，保留时间大约为0.94min。

3．1．2 质谱条件的优化
以MRM方式定量分析灵敏度高，精密度好。

对质谱条件如碰撞能量、锥孔电压等进行了反复测试和优化，发现几个特定的参数对质谱检测的灵敏度有很大影响。

锥孔电压不仅直接关系到碎片解离的方式，对离子流强度也有影响。

当锥孔电压比较低时，样品离子通过样品锥孔的速度降低，撞击锥孔或者与源内气体的动力小，分子离子不容易破碎；当增加锥孔电压时，分子离子的速度增加，通过锥孔时，与锥孔或者与源内气体的撞击动力大，分子离子就容易产生断裂，形成源内CID。

图2为改变锥孔电压对总离子流强度的影响。

经过优化，锥孔电压为20V时离子流强度最大，条件最优化。

(a)
(b)
(c)
(d)
图2 锥孔电压对总离子提取流强度的影响（a）15V (b) 35V (c)25V (d) 20V Fig.2 Extracted ion profile at different cone voltage（a）15V (b) 35V (c) 25V (d) 20V
根据丙烯酰胺的质谱解离方式（图3），通过预实验，发现丙烯酰胺解离产生m/z54.8、43.9、27.0碎片。

其中子离子m/z54.8具有较高强度，为母离子（m/z71.6）脱氨（NH3）得到的产物，其强度满足定量分析时的准确度要求。

当碰撞能量8eV时，子离子m/z54.8强度最大(图4)。

因此，使用m/z54.8离子峰面积定量，强度稍小的m/z43.9离子定性。

图3 丙烯酰胺的质谱解离方式
Fig.3 Scheme of mass spectral fragmentation for acrylamide
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
图4不同碰撞能量时的m/z54.8提取流（a）10eV (b)9eV (c)8eV (d)7eV (e)6eV
Fig.4 Extracted ion profile of m/z54.8 at varied collision enegry （a）10eV (b)9eV (c)8eV (d)7eV
(e)6eV
合适的脱溶剂气温（Desolvation temp）也至关重要，由于丙烯酰胺性质不稳定，脱溶剂气温过高可能加快丙烯酰胺分解，降低响应强度；而且脱溶剂气温越高噪声也越大。

若脱溶剂气温过低，无法有效脱去流动相，生成杂质峰。

经过优化，脱溶剂气温设为350℃时为最优。

此外，驻留时间（Dwell time）也影响检测的精确度和灵敏度，增大驻留时间,得到的离子的准确度提高,重现性增加,但是灵敏度降低,反之亦然。

因此，驻留时间设置为0.3较合适。

增大碰撞气流速可增大检测响应，但是增加不明显，因此选择0.2ml·min-1较好。

3．1．3 样品处理优化
据文献报道，丙烯酰胺测定可用固相萃取技术（SPE）进行前处理[10]。

但由于水中丙烯酰胺含量极低，在常温下不稳定，固相萃取过程中，吸附、洗脱耗时长，不利于丙烯酰胺稳定存在，因此使用固相萃取技术（SPE）不适宜作为饮用水中丙烯酰胺分析的样品前处理。

鉴于UPLC/MS/MS的高灵敏度，可直接用滤膜过滤水样后进样分析。

对比使用滤膜过滤后分析以及不使用滤膜直接分析的测定结果，发现平均加标回收率、相对标准偏差相差不大（表1、表2），即滤膜对丙烯酰胺吸附较小，不影响测定的准确度。

分析前，水样须存放于4℃环境下避光保存，以防止水样中的痕量丙烯酰胺分解。

表1 不使用滤膜过滤加标回收率测定结果
Table.1 Recoveries of acrylamide for spiked samples without sample preparation
表2 使用滤膜过滤加标回收率测定结果
Table.2 Recoveries of acrylamide for spiked samples using syringe filter
3．2方法学验证
3．2．1 线性关系与检测限
精密称取丙烯酰胺标准品0.003g,用超纯水溶解配制300mg·l-1溶液，取10μl该溶液与10ml超纯水混合，制成300μg·l-1中间液，用该中间液配制0.09μg·l-1,0.18μg·l-1,0.24μg·l-1,0.30μg·l-1,0.36μg·l-1,0.48μg·l-1，0.60μg·l-1标准溶液。

每次进样10μL，使用MassLynx v4.0软件处理数据，根据峰面积绘制标准曲线。

标准曲线及相关系数如图5所表。

r=0.9997,r^2=0.9994,线性方程为y=136.56x+3.99。

该方法在0.09μg·l-1到0.60μg·l-1间有良好线性。

由于水中丙烯酰胺含量极低，且该范围包括世界卫生组织规定饮用水中的丙烯酰胺的最高限量0.5μg·l-1，因此该方法符合实际分析的要求。

以3倍信噪比在标准曲线查得结果计算，得出该方法检测限（LOD）为0.1μg·l-1。

图5 0.09μg·l-1到0.60μg·l-1的线性标准曲线
Fig.5 Linearity plot for acrylamide response ranged from 0.09μg·l-1 to 0.60μg·l-1 3．2．2 方法精密度与加标回收率
取0.36μg·l-1，0.51μg·l-1,0.60μg·l-1标准溶液，每次进样量为10μl，分别进样5次，计算峰面积，测得相对标准偏差（RSD）,结果如表3所示。

表3 相对标准偏差值（RSD）
Table.3 RSD of samples
浓度（n=5）(μg·l-1）RSD (%)
0.36 4.8%
0.51 8.1%
0.60 3.3%
3．2．3加标回收率
准确量取10ml纯水,，分别配置加标量为0.36μg·l-1、0.60μg·l-1的样品，按上述方法测定，结果如表4。

表4 纯水加标回收率测定结果
Table.4 Recoveries of acrylamide for spiked pure water
编号加标量
（μg·l-1）
浓度
(μg·l-1)
回收率
(%)
编号加标量
（μg·l-1）
浓度
（μg·l-1）
回收率
(%)
1-1 0.36 0.32 88.9 2-1 0.60 0.62 103.3 1-2 0.36 0.32 88.9 2-2 0.60 0.59 98.3 1-3 0.36 0.36 100.0 2-3 0.60 0.59 98.3 1-4 0.36 0.38 105.6 2-4 0.60 0.61 101.7 准确量取10ml出厂水，分别配置加标量为0.36μg·l-1、0.60μg·l-1，的样品，按上述方法测定，结果如表5
表5 实际样品加标回收率测定结果
Table.5 Recoveries of acrylamide for spiked samples
编号加标量
（μg·l-1）
浓度
（μg·l-1）
回收率
(%)
编号加标
（μg·l-1）
浓度
(μg·l-1)
回收率
(%)
3-1 0.36 0.35 97.2 4-1 0.60 0.63 105.0 3-2 0.36 0.34 94.4 4-2 0.60 0.64 106.7 3-3 0.36 0.36 100.0 4-3 0.60 0.60 100.0 3-4 0.36 0.37 102.8 4-4 0.60 0.61 101.7
由表4计算得出纯水样品平均加标准回收率为98.1%，回收率范围为88.9%-105.6%。

由表5计算得出实际样品平均加标准回收率为101.0%，回收率范围为94.4%-106.7%，相对标准偏差
分别为7.7%、3.3%（n=6）。

通过对比发现，纯水样品加标回收率与实际样品加标回收率相差不大，回收率结果令人满意，因此该法重现性好，精密度高，符合一般检测要求。

4 结论
建立了利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪测定水中的痕量丙烯酰胺的方法。

该法采用PTFE滤膜过滤水样，Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm)柱，以0.1%甲酸和甲醇为流动相（体积比95：5）进行分离。

以外标法定量分析，在0.10μg·l-1到0.60μg·l-1有良好线性范围。

具有样品处理简单、测定周期短、灵敏度高、重现性好等优点，适用于在环境实验室中饮用水中痕量丙烯酰胺的测定。

参考文献
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（QUANTITION OF LOW-LEVEL ACRYLAMIDE IN WATER BY
LC/MS/MS）
ZHANG Ling-yun1, WU Zi-tong2, LIU Bo1, XU Rong1, TAN Mei-lin1, ZHAO Yu1
（1 Water quality monitoring station, Shenzhen water(group)co.,ltd, Shenzhen, 518000, China;
2 School of science, Wuhan University of Technology, Wuhan, 430070, China）
Abstract
A liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC/MS/MS) method is developed for quantitation of acrylamide in drinking water using positive electrospray ionization(ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM). Chromatographic separation is carried out through Acquity HSS T3(1.8μm,2.1X50mm) column using 0.1% formic acid/methanol as the mobile phase. External standard(ES) method is carried out in quantitation. The method confirms good linearity between 0.10μg·l-1and 0.60μg·l-1. Limit of detection isμg·l-1. Overall recoveries are between 88.9% and 106.7%.The method is suitable for determination of low level acrylamide in drinking water due to its high sensitivity and good repeatability, which plays a vital role in water quality monitoring.
Keywords: mass spectrometry,LC/MS/MS,acrylamide, Drinking water,external standard。