酶制剂生产工艺学

酶制剂生产工艺学
1、酶工程
酶：酶是由活细胞产生的，在细胞内、外一定条件下都能起催化作用的具有高效率和高度专一性的一类特殊蛋白质，酶能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使得生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢中。

（核酶是唯一的非蛋白酶。

它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。

）
酶工程：利用酶或细胞的催，化作用，在特定的生物反应器中，将原料转化成所需的产品并应用于社会生活的一门科学技术。

转换数（Kcat）:又称分子活性，或摩尔催化活性，指单位时间内，酶分子中每个活性中心或每个酶分子所能转化的底物分子数，单位为1/min。

是酶催化效率的一个指标。

（催化周期（T） : 指酶进行一次催化所需的时间，为转换数的倒数，单位为毫秒(ms)或微秒(μs)。

）
比活力：可用来表示酶制剂的纯度或活力的高低，是酶纯度的一个指标。

在特定条件下，单位质量的酶（蛋白或RNA )所具有的酶活力单位数称为酶的比活力（specific activity）。

（酶的比活力 = 酶活力（U）/mg（蛋白或RNA )）
酶活力：又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力可用酶催化的某一化学反应的速率来表示。

化学反应的速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。

酶活力单位（U）: 表示酶量多少的单位，在特定条件下，每分钟催化1umol 的底物转化为产物的酶量。

（1961年国际生物化学学会酶学委员会）
酶活国际单位：即催量（kat），在最适条件下，每秒钟催化1mol的底物转化为产物的酶量。

（1972年国际酶学委员会）
1kat = 1mol/s = 60mol/min = 6×107U
酶反应动力学：研究酶反应速度规律以及各种因素对酶反应速度影响的科学。

简要回答酶的催化特点。

答;1.催化效率高;2.专一性强;3.反应条件较温和;4.活性可以调节
补充：1.酶的催化速率是没有催化剂催化的化学反应速率的1012～1020倍，比一般催化剂催化反应的速率高107～1013倍。

2.绝对专一性：只作用于一种底物；相对专一性：作用于一类化合物或一类化学键；立体异构专一性：旋光异构专一性、几何异构专一性
3.酶促反应受一系列外界理化性质的影响，如：①底物浓度及酶与底物的相对浓度；②温度；③pH值；
④激活剂；⑤抑制剂；⑥强酸/强碱；⑦重金属盐；⑧紫外线等。

4.酶调节：酶活性的调节；酶合成的调节。

酶的分类与命名
答：国际系统分类法：1.氧化还原酶类；2.转移酶类；3.水解酶类;4.裂解酶类;5.异构酶类;6.合成酶类
EC（Enzyme Commission）命名法：ECx.y.z.n（x：酶所属大类1~6；y：大类下的亚类；z：各亚类下的亚亚类；n：亚亚类下的具体的个别酶的顺序号）
x,y,z编号中的前三个数字表明了该酶的特性如反应物的种类、反应的性质。

简要回答影响酶催化作用的因素。

答：1.底物浓度的影响（矩形双曲线：一级反应；混合反应；零级反应。

底物抑制：有些酶在高底物浓度下，速度没有维持较高水平，反而下降的现象）；2.产物浓度的影响（反馈调节作用：许多代谢途径的中间产物或终产物是酶的变构剂，使酶变构从而影响其反应速度）；3.酶浓度的影响（在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比）；4.温度的影响；5.pH的影响；6.抑制剂(inhibitor)的影响；7. 激活剂(activator)的影响
简要回答米氏方程、米氏常数的意义。

答：米氏方程的意义：（1）通过酶反应动力学常数可以反映出反应性质、反应条件、反应速度之间的关系（2）反映出反应速度与底物浓度之间的关系。

（3）反映出反应速度与酶浓度之间的关系。

米氏常数的意义:（1）Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。

当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。

（2）Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。

（3）1 / Km可近似表示酶与底物亲和力的大小。

（4）已知Km可由[S]计算v，或由v计算[S]。

（5）Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。

可逆抑制的酶动力学
答：竞争性抑制:Km值增大，Vm值不变；非竞争性抑制：Km值不变，Vm值降低。

反竞争性抑制：Km减小，Vm降低。

补充：1.抑制剂：指能降低酶的活性，使酶促反应速率减慢的物质。

2.抑制作用：抑制剂与酶分子的必需基团结合后，使这些基团的结构和性质发生改变，从而引起酶活力下降或丧失。

以上作用相反的：激活剂、激活作用
3.（1）不可逆的抑制作用：抑制剂与酶以共价键结合，不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。

（2）可逆的抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合，可以用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活。

4.酶活力测定是通过“可视化”酶催化其特定底物为产物，可用终止反应法或连续反应法进行测定。

通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。

5.酶的专一性假说：锁钥学说、诱导契合假说（酶受底物诱导而变形）、张力学说（应变效应）—底物变形以适应酶。

2、酶的发酵工程
诱导物：诱导酶起始合成的物质。

诱导作用；应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导
终产物阻遏：某一代谢（合成）途径的终产物阻遏合成途径中酶的合成的现象。

分解代谢产物阻遏：当培养基中存在两种碳源（底物）时，容易利用的碳源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合成的现象。

葡萄糖效应：葡萄糖抑制微生物利用其他碳源（底物）的现象。

酶生物合成的调节机制: 乳糖操纵子（诱导物、CAP效应）、色氨酸操纵子（衰剪子（前导肽）、色氨酸阻抑物）、衰减子
在酶的发酵生产过程中，提高酶产量的措施有哪些
答：（1）添加诱导物：（诱导物类型：作用底物、反应产物、底物类似物）；（2）降低阻遏物浓度：分解代谢物阻遏、末端产物（反馈）阻遏；（3）添加表面活性剂：非离子型表面活性剂，如吐温80；（4）添加产酶促进剂。

补充：（细胞分化改变酶的生物合成；基因扩增加速酶的生物合成（特定蛋白质编码的基因拷贝数选择性地增加）；增强子促进酶的生物合成；）
微生物产酶菌种的要求(安全、高效、方便、成本低)
答：（1）酶的产量高；（2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便于管理；（3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性；（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低；（5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶；（6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不影响生产人员的身体健康；（7）基因工程菌必须符合安全性要求。

培养基成分对产酶的影响
答：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂（表面活性剂、植酸钙镁、LS(脂肪酰胺磺酸钠)、聚乙烯醇、EDTA等）
培养条件对产酶的影响与调节控制
答：温度、pH、溶解氧、搅拌、泡沫、湿度等。

酶合成的几种不同方式及其产酶动力学
答：同步合成型：酶合成与细胞生长同步。

当细胞进入对数生长期，酶大量生产；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成停止。

所以，同步合成型又称为生长偶联型。

属于这种类型的酶，其生物合成可被诱导，但不受分解代谢产物和尾产物阻遏，而且，当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止。

这表明，这类酶所对应的mRNA是很不稳定的。

延续合成型：酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。

此类型的酶可受诱导，但不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应的mRNA是相当稳定的，可在生长平衡期后一段时间内继续用于酶的合成。

中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在进入细胞平衡期之后，酶的合成也终止。

这类酶受到尾产物阻遏，其对应的mRNA是很不稳定的。

滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后，酶才开始合成并大量积累。

许多水解酶类属于此类。

它们在细胞对数生长期不合成，可能是受到分解代谢产物阻遏作用的影响。

当阻遏解除后，酶开始合成，其对应的mRNA稳定性高。

补充：1.mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在，是影响酶生物合成模式的主要因素。

2.为了提高酶产率和缩短发酵周期，是延续合成型。

因为细胞开始生长就有酶产生，细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续生成一段时间。

3.对于其他合成类型的酶，要在细胞选育上并在工艺条件方面加以适当调节：（1）对于同步合成型，尽量提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度
等。

（2）对于滞后合成型，要尽量减少阻遏物，使酶的合成提前开始。

（3）对于中期合成型的酶，则要从提高mRNA的稳定性以及解阻遏两方面进行。

发酵的几种不同的方式
答：按照发酵基质分：固态发酵、液体深层发酵。

按照物料交换情况：分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。

3、酶分离工程
酶的分离纯化有哪几个重要的步骤
答：一般包括四个阶段：预处理、粗分离、细分离、成品化。

细胞破碎的方法
答：机械破碎法（捣碎、研磨、匀浆）、物理破碎法（温差[反复冻融法，可加蛋白酶抑制剂,还原剂]、压差[高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法]、超声波[空穴作用]）、化学破碎法（有机溶剂破碎法：[甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等]、表面活性剂破碎法[Triton、Tween等]）、酶促破碎法（外加酶法、）
酶提取的方法及影响因素
答：盐溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法等。

影响因素：1.温度有机溶剂（0~10℃），在不影响酶活力的前提下，适当提高温度。

2.pH。

在保持酶稳定的前提下，远离酶的等电点；3.搅拌。

适当搅拌，但速度不能过快；4.污染。

微生物污染，防止蛋白酶降解，重金属污染；5.提取液的体积。

原料体积3~5倍，少量多次。

双水相萃取和反胶束萃取的原理及运用
答：1.某些亲水性高分子聚合物在水溶液中混合达到一定的浓度后，可自发形成分别富含有两种不同聚合物的两个相，由于两个相都是水溶液（相），称为双水相系统。

利用双水相系统进行的萃取称为双水相萃取。

特点：可用于酶或蛋白质等生物大分子的萃取，操作条件温和，不易导致目标产物的变性失活，可从细胞破碎液中直接萃取胞内目标产物，相平衡时间短。

成本较高，选择性不高，分离后产物浓度低。

2.表面活性剂分子在有机溶剂中达到一定的浓度后，可自发地形成疏水性尾部朝外亲水性头部朝内，含有水分子内核，纳米级透明的热力学稳定的聚集体，称为反胶团（reversed micelles ）。

利用反胶团进行的萃取称为反胶团萃取。

反胶束萃取原理：利用酶或蛋白质等电解质与反胶团中表面活性剂分子亲水性头部所带荷电基团之间的静电作用以及反胶团的空间排阻作用来促使目标产物向反胶团中溶解。

色谱层析的几种方法和原理
答：1.凝胶层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、分子排阻层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。

凝胶层析固定相是多孔的凝胶颗粒，内部具有立体网状结构。

当样品进入层析柱后，各个组分就会在凝胶颗粒内进行不同程度扩散，扩散程度与组分分子大小和形状相关。

2.吸附层析：利用吸附剂内部和表面分子受到的作用力不相同，来实现对溶液中溶质（被吸附物）的吸附。

这种吸附作用主要依靠范德华力，是可逆的，通过改变洗脱剂等条件可实现吸附与解吸附之间的转变。

3.分配层析（partition chromatography）是利用样品中的组分在两相间的分配系数不同而实现分离的一种技术。

其中，分配系数指的是溶质在互不相溶的固定相和流动相中溶解达到平衡后，固定相中溶质的浓度与流动相中溶质的浓度的比值。

根据层析支持物的不同，采用两种分配层析：纸层析和薄层层析，可用于微量分析，也可用于样品制备，但对酶等生物大分子的分离效果不理想。

4.离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。

5.亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力进行分离纯化技术。

当混合样品随流动相通过固定相时，各组分在固定相间发生扩散，并与配体不断发生碰撞。

只有与配体的空间构象互补，或可以发生可逆共价结合的特定蛋白质组分，才能与配体发生可逆的特异性结合而被截留在固定相上，其他非特异性蛋白质则随流动相流出层析柱。

然后通过加入过量游离的可溶性配体或加入能改变配体与蛋白质特异结合力的物质，将特异性蛋白质从固定相上洗脱下来。

6.疏水层析：疏水的配体通过疏水作用与样品中疏水基团可逆结合来实现分离的一种技术。

、
7.高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）：高效液相色谱仪主要由五部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。

8.快速蛋白液相色谱 (FPLC)(Fast protein liquid chromatography)：原理：与高效液相色谱理论类似
分离：蛋白质、多肽及多核苷酸的系统（优点：不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性）。

10.灌注色谱法(Perfusion chromatography)就是采用大孔填料，在高流速下产生溶质随流动相穿透填料粒子的传质方式的新型色谱技术。

酶结晶的基本原理及影响结晶的主要因素。

答：结晶（crystallization）：是指溶质分子通过氢键、离子键或其它分子间的作用力周期性地排列成一种有规则的固体形式的过程。

1.酶的纯度——一般酶纯度应达到50%以上。

2.酶蛋白的浓度——对大多数酶来说，蛋白质浓度在1-5%（ 3~50mg/mL）较好。

3.晶种——有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶。

4.温度——一般控制在0~4℃范围内。

5.pH值——一般选择在被结晶酶的pI值附近。

补充：酶制剂的剂型主要包括液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、结晶酶等，为了延长蛋白质产品的货架期，需要考虑添加稳定剂。

利用本章所学的各种分析技术对特定的蛋白酶进行分离纯化
注：类弹性蛋白介导的分离提纯（见ppt）
补充：1.电泳，电泳原理：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。

带电性质、颗粒大小和形状不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，故此可使它们分离。

电泳分离技术按照支持介质种类可分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳、双向电泳等。

4、固定化酶及固定化细胞
游离酶、固定化酶和固定化细胞作为催化剂的优缺点
答：游离酶的缺点：稳定性差,易变性；一次性，难回收；蛋白酶自水解；分离纯化困难。

固定化酶的优点：1.大多数情况下，固定化酶的稳定性有所增加，包括：热稳定性、pH稳定性、对变性剂的耐受力、贮存稳定性、操作稳定性。

2.固定化酶的最适温度比游离酶提高。

3.利于分离纯化，酶回收再利用。

缺点：一般来说，固定化酶的活力比游离酶的活力低。

固定化细胞：优点：1.省去了酶的分离纯化过程，可显著降低生产成本；2.多酶系统，无需辅因子再生；3.耐受性增强，可重复使用，节省了细胞培养过程；
4. 酶的稳定性增加。

缺点：1.细胞膜和细胞壁对底物和产物产生扩散障碍；2.形成大量副产物；3.降低产物的纯度或增加下游工艺的难度；4.催化活性的维持较复杂。

酶的固定化方法、固定化的基本原理以及各自的优缺点
答：
1.
固定化的基本原理：
（一）吸附法：通过氢键、疏水作用、范德华力、离子力等物理吸附作用，将酶固定在水不溶性载体表面的固定化方法。

物理吸附法：范德华力、氢键、疏水作用。

优：操作简单；酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少；酶失活后载体仍可再生。

缺：酶与载体相互作用力弱；对离子强度、pH、温度等因子敏感，酶易脱落导致酶活下降并污染产物；最适吸附酶量无规律可循。

离子吸附法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。

优：操作简单；处理条件温和；酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏；酶活回收率较高。

缺：载体和酶的结合力比较弱；容易受缓冲液种类或pH的影响；在离子强度高的条件进行反应时，酶易从载体上脱落。

生物特异性吸附：这种固定化方法是依据互补生物分子间的亲和作用而将酶间接固定在载体上。

（2）包埋法：将酶分子截留或包裹在载体的网状结构中，从而将酶固定的方法。

优点：。

优点：作简单；酶分子只被包埋，未受到化学反应，酶活力回收率较高，可以制得较高活力的固定化酶。

缺点：不适合于作用大分子底物或生成大分子产物的酶的固定化；凝胶网格对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。

1. 凝胶包埋法：将酶分子包埋在凝胶的内部网孔中。

1）聚丙烯酰胺凝胶包埋法：优点：制备相对比较简单，酶的活力回收率较高
缺点：酶容易漏失，游离的丙烯酰胺单体具神经毒性
2）海藻酸钙包埋法：藻酸钙凝胶网络的孔隙尺寸太大，酶可能会从网络中泄露出来，因而，不适合于大多数酶的固定化。

3）琼脂凝胶包埋法：优点：包埋活性较高，制作较容易。

缺点：氧和底物及产物的扩散受到限制，琼脂凝胶的机械强度较差，且成球受温度影响较大。

4）辐射包埋法：电离辐射能引发产生自由基，诱发单体合成高分子聚合物来包埋酶。

如水凝胶。

2. 纤维包埋法：先将酶的水溶液在高聚物的有机溶剂中进行乳化，再通过多孔喷丝头将乳化液挤压进入凝结液中，即可形成丝状的纤维包埋体，酶被包埋在纤维束中。

特点：该方法对酶有较高的包埋容量，并且对酶包埋牢固。

适用于大规模生产。

3. 半透膜包埋法：将酶包埋在半透过性的高分子聚合物膜内的固定化方法。

只适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。

固定化酶呈小球状，直径只有1~100um，称微胶囊
（三）共价结合法：利用酶分子表面的功能基团与载体表面的功能基团之间的化学反应形成共价键，通过共价键将酶与载体结合，从而使酶固定化的方法。

特点：酶与载体结合牢固，不易脱落，但酶活力易损失，酶活收率低，操作步骤繁琐。

（补充：载体活化方法：1. 溴化氰法：适用于含有邻羟基载体的活化，如纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。

在碱性条件下，载体羟基与CNBr反应，生成亚氨基甲酸酯类衍生物，在弱碱性条件下与酶分子中氨基反应，将酶固定。

2.乙基氯甲酸酯法；3. 碳二亚胺法；4.重氮法；5.3-氨基丙基三乙基氧硅烷法（APTS 氨化法）；6.戊二醛活化法；7.叠氮法：叠氮衍生物可与酶蛋白的氨基、羟基、酚基或巯基反应）。

（四）交联法：利用双功能试剂（戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等）在酶分子之间或酶分子与载体之间进行交联反应，从而使酶固定的方法。

1.交联酶法：反应比较剧烈，酶蛋白中的功能基团如氨基、酚基、巯基和咪唑基等可能参与反应，所以酶的活性中心构象可能会发生改变。

酶活损失大，固定化酶机械强度不足，颗粒较小。

2.共交联法：指酶分子在双功能试剂或多功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶的载体之间发生交联，又称为载体交联法。

如何评价固定化酶的固定化效果
答：1.固定化酶的活力测定（其活力可在两种基本系统——填充床或均匀悬浮在保温介质中进行测定。

间歇测定法和连续测定法）；2.固定化酶的比活力；3.酶的固定化效率与酶活力回收率；4.相对酶活力（相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值）5.固定化酶的操作半衰期（在连续测定或使用条件下，固定化酶活力下降为最初活力一半时所经历的连续工作时间。

）。

固定化对酶性质的影响
答：1.固定化酶的活力变化：一般来说，固定化酶的活力比游离酶的活力低。

原因：① 空间构象变化；② 活性中心关键基团与载体结合；③ 底物与产物的屏蔽效应或扩散障碍。

2.固定化酶稳定性的变化：大多数情况下，固定化酶的稳定性有所增加，包括：热稳定性、pH稳定性、对变性剂的耐受力、贮存稳定性、操作稳定性。

原因：① 分子结构刚性增加，可防止变性；② 有效抑制降解；
3.固定化酶最适温度的变化：固定化酶的最适温度比游离酶提高。

最适温度的高低与固定化方法和所使用的载体有关；
4.固定化酶最适pH的变化：固定化酶的最适pH常会发生偏移。

与载体的荷电性和产物的酸碱性有关。

载体带负电荷或产物呈酸性导致最适pH升高，载体带正电荷或产物呈碱性导致最适pH 下降。

5.固定化酶的底物特异性：与底物分子质量的大小有一定关系。

对于那些既可作用于小分子底物，又可作用于大分子底物的酶，固定化酶的底物特异性会偏向小分子底物。

由于载体的空间位阻作用引起。

五、化学酶
简述酶分子化学修饰的基本原理，及酶化学修饰方法。

答：利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性，直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而使酶分子的结构发生改变。

1.重要的修饰反应：酰化、烷基化、氧化还原、芳香环取代；
2.酶分子侧链基团的化学修饰（酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。

主要包括氨基、羧基、羟基、巯基、胍基、咪唑基、甲硫基、酚基等。

侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。

）
3.酶分子表面的化学修饰采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶的性质发生改变，以满足人们的需要。

（常见的修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。

常用的大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。

）。