第七章食品中常见病原菌微生物检验技术

【方法】 （1）玻片法 （2）试管法 【结果判断】 （1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。 （2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳 性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再 观察。 【应用】 本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。
金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以 和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素 方法主要有： 1.免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验 3.免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法
醇发酵试验
邻硝基酚β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
阳性（黄）
阴性
5.血清学分型鉴定
提供培养物菌种的鉴定。 用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O 血清及H因子进行玻片凝集试验。 1）抗原的准备 2）O抗原的鉴定 用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理 盐水做对照。 3）H抗原的鉴定 4）Vi抗原的鉴定
时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现 凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以 血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1 ℃

我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落
总数、大肠菌群和致病菌三项。

致病菌：能够引起人类发病的细菌。对不同的食 品和不同的场合，应该选择一定的参考菌群进行
检验。
第一节 沙门氏菌检验技术
一、生物学特性 是一大群在血清学上相关的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、 无荚膜，周身鞭毛，能运动的需氧或兼性厌氧短杆菌。
尿素酶试验 阴性（黄）阳性（红）
靛基质
对照管
阴性(－)
阳性(＋)
• P150 • （1） A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨 酸脱羧酶3项中有1项异常，按表可判定为沙门氏菌属。如有2项 异常，为非沙门氏菌属。 （2）A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体 两项实验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 （3）A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱 羧酶阳性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 （4）必要时进行沙门氏菌生化群的鉴别。
天，在冰块中存活96天，蝇肠内可存活9-10天，
对化学消毒剂敏感，1%石碳酸15-30分钟死亡。
急性胃肠炎
败血症
猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌 鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌
二、检验所需器材
三、检验程序
沙门氏菌检验程序2010
四、操作方法

分五个步骤：
1.前增菌

2.选择性增菌

3.选择性平板分离
4.生化实验 5.血清型分型鉴定



• <国标>检测沙门氏菌方法分5个步骤：
•
1.前增菌： 在含有营养的非选择性培养基
镜检 营养肉汤
36± 1℃ 24hr
血浆凝固酶 实验
36± 1℃ 6hr
第一法
报告结果
第二法 Baird-Parker平板法检验程序
定量检测 （平板法）
适用于检测金黄色 葡萄球菌数不小于 10/g（mL）的食品
定量 检测
（MPN法）
25g样品+ 225ml 生理盐水
梯度稀释
选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤
荚膜。

最适生长温度37℃，最适pH 为7.4，对热抵抗力较强， 80℃30min才能被杀死。

可在10%-15%氯化钠和40%胆
汁中生长
生物学特性---培养特征
大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到 浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中 可能也有变化


可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲
•


多数产肠毒素的菌株在血琼脂平板上能形成溶血圈，并能产
生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
四、操作方法
1.增菌培养法
（1）检样处理 将25g（mL）检样加于225mL灭菌生 理盐水中的灭菌器内，制成1：10检样混悬液。 （2）增菌培养 吸取液体检样5ml，接种于50mL7．5 ％氯化钠肉汤50ml进行增菌。 （3）分离培养 将上述培养物，分别划线接种到 BairdParker 平板和血平板。 血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 或 45 h～48 h。
亚硫酸铋琼脂(BS琼脂)上典型特征
木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼 脂上典型特征
HE琼脂上典型特征
4.生物化学试验筛选

挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落， 接种于三糖铁琼脂培养基中。

排除大多数非沙门氏菌。也提供了
沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。
TSI(三糖铁)培养基 大肠杆菌和沙门氏菌
沙门菌常用生化试验
，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色 葡萄球菌； e.肠毒素：产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，现已鉴定出葡萄球菌肠毒素
有A、B、C1～C3、D、E、G、H共9种。肠毒素A是最常见的。
葡萄球菌皮肤感染
金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型
对分型进行简单的了解。 １、血清学分型： 金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和 多糖抗原。
蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一种表面抗 原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。 多糖抗原为半抗原，有型特异性。 ２、噬菌体分型。 ３、根据肠毒素分型。 ４、根据血浆凝固酶分型。
血浆凝固酶试验：
吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试管中，
再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培
养物0.5 mL，振荡摇匀，置 36±1℃温箱或水浴
内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝块,
即将试管倒置或 倾斜时，呈现凝块者，被认为 阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及 肉汤作为对照。
培养 18 h～48 h，重复试验。
检测步骤--鉴定
金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对其 鉴别的主要实验是测定其凝固酶。 对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其他 实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖发酵、溶
葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核酸酶实验等。
所有这些实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。
第二节 金黄色葡萄球菌检验技术
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌的流行病学
近年来，美国疾病控制中心报告， 由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位， 仅次于大肠杆菌。 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫 生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素
引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的
33%，加拿大则更多，占45%，我国每年
二、检验所需培养基

10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤
7.5 %氯化钠肉汤
血琼脂平板 Baird-Parker 琼脂平板 脑心浸出液肉汤(BHI) 兔血浆


磷酸盐缓冲液
营养琼脂小斜面 革兰氏染色液 无菌生理盐水
三、检验程序

GB 4789.10-2010标准 第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；
36± 1℃ 4548hr
BP平板
适用于检测可能含 有少量金黄色葡萄 球菌，却带有大量 竞争菌的样品
36± 1℃
45-48h
血浆凝固酶 实验
查MPN表
第三法 金黄色葡萄球菌MPN检验程序 报告结果
金黄色葡萄球菌的检测－－测定方法

国标方法注意事项
•
现象观察：染色镜检（形态、染色）
表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多数为金黄色。 Baird-Parker琼脂平板（BP平板） 、血平板 、血浆凝固 酶试验
菌以外的细菌（主要是艾希氏菌属）受到抑
制，而使沙门氏菌得到一定的增殖，提高沙
门氏菌的检出率。

3.选择性平板分离
划线接种于： BS和XLD琼脂平板或HE琼脂平板各一个，于36+1℃


分别培养18—24小时(XLD、HE)或40—48小时(BS)。

这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提 供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。
（5）革兰氏染色镜检 （6）血浆凝固酶试验

挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别
接种到 5 mL BHI 和营养琼脂斜面，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物 0.2
mL～0.3 mL，振荡摇匀，置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小
（4）观察菌落形态


Baird-Parker 平板、血平板上挑取可疑菌落。
金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径
为 2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周
围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌
落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的
类似菌落；但无混浊带及透明圈。 在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿 润、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶 血圈。
基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化 明胶。 具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉
素、红霉素等高度敏感。